Re: [問題] 請問ligation的一些問題
※ 引述《pwl.bbs@ptt.cc (蓄勢待發)》之銘言：
> ───────────────────────────────────────
> 我覺得你的做法好像怪怪的
> : f大大
> : 可否請教一下您家都用什麼方式純化嗎
> : 因為我們家 都亂用 大家都覺得純化效率很差
> : 目前我取60ul(3000ng/ul)的dna去切 (我強烈懷疑這個質是假的
> 這個DNA的量真的很多耶...總共有180ug呀...
> 那麼你是使用多少酵素去切呢
> 如果是NEB的EcoRI的話1ul是20U(印象中)
> 那麼需使用9ul的酵素???
這邊我是用NanoDrop去測的
也是分光光度計的一種
測出來的值就是怎麼高
所以我很懷疑他是假的
對了 我只用了0.5ul的酵素去切
跑膠 只出現一條band
> : 但最後膠純化後體積100ul
> 通常膠體純化不會溶於這麼多水阿
> 為了讓DNA的濃度提高
> 大概只會用30ul的水
此部分嘛
因為本實驗室的人都懷疑純化效果不好
你也看到了 我拿了果此多的dna量去做
所以依column的建議50ul的效果最好
所以我用兩管 共是100ul
最後transformation前來個大濃縮
> : 濃度我估計只有5ug/ul 也就是我切了如此大量的dna卻只回收到500ng左右
> DNA有兩種定量方式
> 跑膠或是測OD
> 為什麼要自己估計阿
> 可以回收5ug/ul...這個量真的不是普通的高耶...
> 而且5ug/ul體積100ul那麼總共是500ug的DNA阿...不是500ng
很明顯 是打錯了
是5ng/ul
我的估計指的是跑膠估計
後來有去測分光光度計上面那台
濃度是3ng/ul
> 還有原本只有180ugDNA,為什麼純化後有500ug的DNA啊
> 你是不是寫錯了???
> : 所以想請教一下f大 用了多少dna去切 用什麼方式純化
> 如果是用column純化的話
> 有最大量的限制
> 大概是40ug左右(廠牌不同會有所差異)
所以效率明顯不好
真怪
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