※ 引述《ai760721 (蜜汁排骨飯)》之銘言：
: 各位大大好
: 事情是這樣的
: 我從FFPE的sample中抽取出了gDNA
: 要從裡面去P某段可能有mutation的地方
: 位子是在某個基因的Promoter靠近ATG的地方約100多bp
: 但是陸陸續續P了一個多月 始終都是P不出來
: 試過以下方法
: 增加DNA的量、Dilute DNA、通PCR inhibitor colume、增加primer量、增加cycle數、降
: 低annealing temperature、加DMSO、換Hot start的Taq、換過五組primer、做nested
: PCR
個人建議,
1. 換polymerase. 有時後有些產物taq就是不喜歡, hot start也沒有差別
2. try touch down PCR
3. 確定你的genomic DNA的品質, extraction時有沒有把EtOH洗乾淨
4. 確定PCR reagent是fresh的, 尤其是dNTP
5. 改變Mg濃度 (其實一般troubleshooting前幾步就應該考慮Mg了)
6. genomic DNA使用前vortex程度眾說紛紜. 有人是主張輕微vortex,
有人則是很極端覺得要把genomic DNA盡可能打碎到最小碎片, 所以我看過有人堅持
vortex 5分鐘的. 我不認為有什麼差別--你打的再碎都還是不會比你的primer或你p
的片段小. (用sonicator要打到幾百bp都需要蠻高的轉速了, 你只是vortex而已)
既然你現在什麼都p不出來什麼都可以試試
我之前為了p一段1kb的產物作了三個月, 我的產物本身是tri-nucleotide repeat
如CAGCAGCAG..或GAAGAAGAAGAA..等. DNA本身自己會形成二級結構(已被證實), 所以
同領域的大家PCR都很難作. 那三個月每天除了狂作PCR外就是不停的上網查所有人家
講的困難PCR的招式. 最後是在換了第三個polymerase (pfx)之後順利p出來,
但還是有一定的條件, 例如genomic DNA vortex的程度, dNTP退冰的方式
(我試過, 在冰上thaw就會作的出來, 用手thaw就會作不出來)
基本上對簡單的PCR有時你隨便p也會有, 但困難的pcr真的差一點條件就是成與敗的差別.
加油!
: 通通沒用
: DNA有跑過電泳 亮帶大約是在400左右
: 也有P過其他基因 是可以P出來的
: 唯獨我要P的這個地方怎麼P都P不出來
: 請問各位前輩 還有什麼方法可以調整的嗎??
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