[求救] PCR P不出來

看板Biotech作者 (跟著我走你會迷路)時間11年前 (2012/08/28 14:55), 編輯推噓6(6推 0噓 12→)
留言18則, 9人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
我設計了一組 primer 並利用 Biomix 找到 Tm =56.6度 (基因size:787bp) 條件如下: 95度10min-->95度30s,56.6度1min,72度1min(40cycle)-->72度10min-->4度 結果...利用相同條件，只換 enzyme !!! 換成 High fidelity 就 P 不出來 >"< 原本想說可能是 high fidelity 有proof reading 的能力，需要 elongation 時間較長 所以我 elongation 的時間調成 10 min 結果也 P 不出來，學長說可能是 Tm 值太高， 所以我也試著改變 Tm 值 (改成53度) 還是一樣...跑完膠好乾淨 QQ 想請問各位有遇過這種事嗎?該怎麼解決?? -- 生命跟人惡作劇 他騙人化進故事理去活 他用種種的情節引誘著人熱烈的投入 人 先被故事捉進去了 然後 那個手麥田的稻草人 就上當又上當的講了又講 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.92.152
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08/28 15:03, , 1F
你要P的序列是GC rich嗎? 可能你換的enzyme的buffer沒
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辦法解高GC
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比比看兩個enzyme跟buffer的差異 說不定有蛛絲馬跡@@
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推
08/28 16:08, , 4F
High fidelity對於sample DNA濃度有差! 濃度不能太高
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推
08/28 16:20, , 5F
Tm56蠻低的，看你template是什麼吧
08/28 16:20, 5F
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08/28 16:21, , 6F
不同酵素要參考protocol，說不定它適合hot start?
08/28 16:21, 6F
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08/28 16:22, , 7F
也說不定它適合更高的Tm值，我們用的習慣都是58-60度
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推
08/28 16:43, , 8F
都設計在60度附近+1
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推
08/29 00:50, , 9F
tm 可以到66度都還ok 只要Primer夠長
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推
08/29 00:55, , 10F
加長primer應該比較有幫助
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08/29 03:27, , 11F
primer影響最大 新primer我都先拉gradient 50-65
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08/29 14:29, , 12F
謝謝大家我再試試看><
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推
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95 度 10 min @"@? 是哪一家的啊 我 hot start 都 5 min
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而已， 10 min 酵素還OK嗎 XDD
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08/31 22:26, , 15F
我的hot start也是需要10分鐘，並非不常見吧。一輪30幾
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cycles的PCR跑下來，少說也需要兩個小時，Taq衰退也是比
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較後期的事。一開始95度C多五分鐘有差嗎？畢竟每個廠牌
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08/31 22:29, , 18F
的hot start polymerase製程不同，依原廠說明時間即可。
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文章代碼(AID): #1GF6jDg3 (Biotech)
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