[求救] Co-IP

看板Biotech作者 (miu)時間11年前 (2013/03/25 12:45), 編輯推噓5(5推 0噓 20→)
留言25則, 10人參與, 最新討論串3/3 (看更多)
嗨 大家好!! 小妹我的coIP實驗結果很奇怪， 染出來的band蠻雜的，而且都很亮，但偏偏就沒有我要看的目標kDa ... 所以想請教大家，不知道是不是實驗方法還是哪邊出了問題 我做的實驗步驟是: 將萃取好的protein定量後加入A抗體及PBS室溫搖晃反應overnight 再加入protein A/G 搖約120分鐘(室溫 離心後，用PBS清洗三次，去上清液後留下沉澱物 再加入dye，95度下反應後把上清液拿來跑western再染抗體B 請問這樣子的實驗步驟是正確的嗎? 染完膜後kDa 是要看B的對不對? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.70.174.13
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03/25 12:49, , 1F
B只是拿來染western，並沒有跑SDS-PAGE不是嗎??
03/25 12:49, 1F
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03/25 12:51, , 2F
先染個A看看有有沒抓下來吧
03/25 12:51, 2F
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03/25 13:42, , 3F
很少人忍心讓lysate室溫下被抗體抓整天,protocol有來源嗎？
03/25 13:42, 3F
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03/25 13:45, , 4F
看一下你的A,B的MW,上述各抗體物種,大概就有機會知道原因了
03/25 13:45, 4F
推
03/25 16:48, , 5F
我會先染A 確定有抓到 再染B 另外我們是四度一晚 蛋白用室溫
03/25 16:48, 5F
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03/25 16:49, , 6F
挺危險的吧? 還是有其他文獻是這樣子做的?
03/25 16:49, 6F
推
03/26 10:45, , 7F
室溫overnight?? 你的protocol哪來的…
03/26 10:45, 7F
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03/26 18:38, , 8F
Protocol是買protein A/G附的 SANTA CRUZ的
03/26 18:38, 8F
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03/26 18:39, , 9F
室溫大概25度，Protocol上寫要4度C ，但老闆是說 他以前做
03/26 18:39, 9F
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03/26 18:40, , 10F
在25度C下(也就是室溫，是ok的
03/26 18:40, 10F
推
03/26 22:37, , 11F
真的很少人會把蛋白在室溫下做Co-IP.....
03/26 22:37, 11F
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03/26 22:57, , 12F
室溫....
03/26 22:57, 12F
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03/26 23:07, , 13F
雖然每個人都在意室溫,原po可別當真的拿ptt的推文反駁老師
03/26 23:07, 13F
推
03/27 00:23, , 14F
問一下 染出來的kDa是否都比B小? 如果是的話....
03/27 00:23, 14F
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03/27 00:23, , 15F
大概被降解的可能挺高的
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03/27 00:24, , 16F
還有順便確認一下Input裡面AB是否都正常呢?
03/27 00:24, 16F
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03/27 00:26, , 17F
你可以取一些lysate出來不加sample buffer一起擺室溫
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03/27 00:27, , 18F
看看室溫的影響為何....
03/27 00:27, 18F
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03/27 00:27, , 19F
不過你還是照個protocol跑一遍吧 室溫這麼久
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03/27 00:27, , 20F
蛋白質不壞 抗體都不知道行不行了
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推
03/28 01:18, , 21F
恩 你老板似乎很喜歡你,要讓你留下來慢慢做,通常prote
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in AG加進去後是會放4℃歐
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恩..我是助理 不是研究生所以~跟老闆有沒有要留我下來應
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該枚關係吧 哈哈哈...
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03/28 11:25, , 25F
還有謝謝大家，我會依照建議再做做看
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