Re: [求救] Co-IP
※ 引述《cytospin (無心)》之銘言：
: 請問一下比較好的Co-IP lysis buffer使用什麼比較好
: 現在我就是用普通的lysis buffer (Tris, NaCl, EDTA, 10%glyceral, 還有一堆inhibitor)
: 可是做出來效果不是很好
: 想說會部會我的lysis buffer太強了 (我似乎有看到有人用tritonX-100做)
: 把pt-pt interaction也都打破了
: 我的做法如下:
: 1. 3x 10^7 cells lyzed in 500 ul lysis buffer, 4C, rock for 45 min
: 2. Spin down 20 min
: 3. sup preclean with Trueblot anti Rabbit beads 30 min
: 4. Add 5 ug of primary Ab, 4C rock O/N
: 5. add 50 ul beads 1hr, rock , 4C
: 6. wash twice,
: 7. add 2 X loading buffer , heat 10 min
: 8. spindown, loading
: hmm.....大概就是這個樣子
: 請問Co-IP達人
: 有沒有比較好的建議??
你可以把你的lyse buffer每種成分的濃度PO一下嘛
像salt(NaCl)濃度在IP時會影響protein-protein interaction
detergent也會
另外，lyse和IP時的濃度也會有差
如果你說你上述的NaCl和detergent都沒有調很高
那可能就是lyse時你要的protein大部分沒有溶出來
或是你的protein的sublocalization很多種(核內核外膜上)
以我的經驗，NaCl一般都是用150-200mM即可
Tx-100用0.1或0.2都可以
不管lyse or IP都這樣的condition即可
如果要看的CoIP條件是針對hydrophobic interaction而言
那可能還要再調整了
這是比較特別的例子^^
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