Re: [求救]bisulfite Genomic PCR疑問
我這陣子有做三批bisulfite的PCR
第一次做try得要死才做出來
後來買了Hotstart的PCR mix
結果後來連anneling溫度都不用測就可以P出專一的band
避免幫廠商打廣告 如果有需要的可以站內信問我是用哪支Taq
希望可以幫到大家 ^^
※ 引述《travelmat (草蓆)》之銘言：
: 其實我也有同樣問題...
: 我之前也是有TRY到一個比較好的條件
: 僅管做出來一樣是smear一片，但相對明顯有一條專一性的band(size是我要的)
: 本來預期是以為這樣的condition是非常OK的
: 於是接下來的sample嘗試以同樣condition下去跑
: 卻發現不同sample間無法重覆
: 而即使回到一開始的同樣sample也無法repeat
: 問過別家有在做類似實驗的，學長給我回應是
: 1.我sampleDNA是GENOMIC，genomic pcr本來就很麻煩又複雜
: 2.每次的BISULFITE處理後都視為不同的sample，也就是每次都可能會有不同的condition
: 3.primer suck
: 所以就......
: 而我問我們老師，我們老師給的答案是
: PCR就是一項amprify的技術，所以如果你這次primer能bind到正確的位置
: 那麼他理論上就是會放大，bind的相對多，專一性片段就相對亮
: 而bind的沒相對多，於是就一片smear
: 簡單來講，以我的情況就是要看運氣，這次運氣好就有專一性這樣。
: 我個人做法是把primer anealing的時間拉長，我的想法是
: 這樣讓primer有比較多的機率去bind到正確的片段(當然非專一性的也可能提高)
: 後來用這樣做法的確是相對成功率比較高....
: 不過整體來講還是成功率非常之低.......
: 目前是改成將PCR進TA，然後考慮用colony hybridization去抓哪個colony有我要的片段
: (我好想畢業阿.....)
: 以上希望對你有幫助....
: 如果你有進展也請分享給我和大家.....感謝你....
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