Re: [求救]bisulfite Genomic PCR疑問

看板Biotech作者monicatsen (monicatsen)時間12年前 (2012/09/05 21:22)推噓3(3推 0噓 2→)

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我後來跑出來了! 但其實就很奇妙抓不出PCP成功and不成功的原因XD 給大家參考一下: 轉Bisulfite改用2ug去轉-->產物10ul-->取4ul(用260推算濃度,則是130ng左右) -->去PCR跑溫度梯度這個條件的產物跑膠超明顯但同一批的Sample同條件我隔天再跑產物跑gel就變弱超多的但還好夠我做TA cloning 也有挑到我要的clones 去做sequencing分析後來也有再嘗試看用當天轉bisufite的sample去repeat一次實驗想看看是不是bisulfite處理的sample一定要很"新鮮"的跑結果同樣的條件溫度就沒P出來了所以還是很謎樣的沒有結論~ 之後有新的發現再跟大家說~!! ※ 引述《monicatsen (monicatsen)》之銘言： : 想請問有在做DNA bisulfite PCR的各位 : 我目前的實驗構想 : 是想去看在表現我目標基因的細胞 : 在一些stemness上甲基化程度是否受到影響 : 所以我的實驗流程如下: : bisulfite sequence : 1.抽control及表現我目標基因細胞的gnomic DNA : 2.ZYMO DNA methylation kit : 去modified gnomic DNA : (500ng,是protocol建議的量) : 3.ZYMO產物 : 用吸光值推算濃度,取100ng量跑PCR(用Hot star的DNA polymerase) : 4.PCR product直接送定序 : (因為還不知道會被甲基化的位置，所以想先用這種方式粗略的先分析) : 但我目前的問題是: : 1.PCR沒產物 : 這裡用的PCR primer : primer的序列沒有CG所以只需考慮C-->T的規則 : Tm分別為=48&55 (可以想到可能是兩個溫度差的太大了一點) : 2.ZYMO KIT處理完後,其實產物的濃度不高, : 一次的產物大概只能夠我做一次PCR, : 所以要跑gradient PCR對我而言有點為難阿， : 所以想問大家做後面PCR分析會用多少的DNA? : 想問大家的看法及建議,謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.126.72.32

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soom

09/06 11:48, , 1^F

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datro

09/07 00:18, , 2^F

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travelmat

09/07 09:46, , 3^F

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