Re: [求救]bisulfite Genomic PCR疑問

看板Biotech作者 (草蓆)時間13年前 (2012/09/06 16:57), 編輯推噓0(0推 0噓 10→)
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其實我也有同樣問題... 我之前也是有TRY到一個比較好的條件 僅管做出來一樣是smear一片，但相對明顯有一條專一性的band(size是我要的) 本來預期是以為這樣的condition是非常OK的 於是接下來的sample嘗試以同樣condition下去跑 卻發現不同sample間無法重覆 而即使回到一開始的同樣sample也無法repeat 問過別家有在做類似實驗的，學長給我回應是 1.我sampleDNA是GENOMIC，genomic pcr本來就很麻煩又複雜 2.每次的BISULFITE處理後都視為不同的sample，也就是每次都可能會有不同的condition 3.primer suck 所以就...... 而我問我們老師，我們老師給的答案是 PCR就是一項amprify的技術，所以如果你這次primer能bind到正確的位置 那麼他理論上就是會放大，bind的相對多，專一性片段就相對亮 而bind的沒相對多，於是就一片smear 簡單來講，以我的情況就是要看運氣，這次運氣好就有專一性這樣。 我個人做法是把primer anealing的時間拉長，我的想法是 這樣讓primer有比較多的機率去bind到正確的片段(當然非專一性的也可能提高) 後來用這樣做法的確是相對成功率比較高.... 不過整體來講還是成功率非常之低....... 目前是改成將PCR進TA，然後考慮用colony hybridization去抓哪個colony有我要的片段 (我好想畢業阿.....) 以上希望對你有幫助.... 如果你有進展也請分享給我和大家.....感謝你.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.130.105
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09/06 20:56, , 1F
我會覺得應該是primer沒有設計好耶~~~
09/06 20:56, 1F
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09/06 21:02, , 2F
因為bis的treatment...會牽扯到sample中含有C甲基化
09/06 21:02, 2F
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09/06 21:05, , 3F
多少而定...m跟u的primer上設計的差異點就很重要了
09/06 21:05, 3F
這部份有考慮過 但因為實在找不到其他PRIMER設計位置了 所以只好繼續用這組
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09/06 21:08, , 4F
我也在想你BISULFITE的kit是不是有問題...
09/06 21:08, 4F
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09/06 21:10, , 5F
以前我用gDNA經bis處理過後的sample能冰在-20冰箱很久
09/06 21:10, 5F
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09/06 21:14, , 6F
都還是P的出來...我記得以前我有買過control...
09/06 21:14, 6F
其實我不是用KIT ㄒ_ㄒ 應該不是 gDNA 壞掉的問題 因為其實還是能P ， 偶爾也會有專一性片段出現(但不是我要的) 只是無法REPEAT之前的DATA而已 推測primer穩定性不夠，也就是專一性不夠之類，所以上面第3點才說 primer suck
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09/06 21:15, , 7F
某家公司bis處理過的gDNA...當作實驗的對照...
09/06 21:15, 7F
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09/06 21:17, , 8F
P那個對照就一定會有band..來檢視自己的primer有無問題
09/06 21:17, 8F
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09/06 21:19, , 9F
拿bis未處理跟處理過的sample去sequencing...會比較準
09/06 21:19, 9F
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09/06 21:20, , 10F
如果只是檢測用的話...考慮用Q-MSPCR...taqman probe
09/06 21:20, 10F
我自己是有做control，確定這組primer是可以用的 (指可以P出我要的片段) 但因為我做的control相對實驗組環境比較單純，所以只能確定primer可用 其他就無法確定了 ※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (09/07 09:44)
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文章代碼(AID): #1GI6M05h (Biotech)
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