Re: [求救] 有沒有人用過gel filtration???
※ 引述《premire (熱騰騰的泡麵)》之銘言：
: 原文恕刪
: 參考了sephadex產品說明書 其中一段如下：
: Use 0.15 M NaCl or a buffer with equivalent ionic strength to avoid pH
: dependent nonionic interactions with the matrix. At very low ionic strength,
: the presence of a small number of negatively charged groups may cause
: retardation of basic proteins and exclusion of acidic proteins.
: 根據以上我的解讀是column的metrix是dextran, 帶有負電荷OH group,在極低的離子強度
: 假如sample帶有正負電荷都會和metrix產生吸附或是排斥現象.因此必須要使用0.15M鹽類
: 增加buffer的離子強度,減少sample與metrix的交互作用.
: 另外有提到
: When working with a new sample, try these conditions first: 0.05 M sodium
: phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.0 or select the buffer into which the product should be
: eluted for the next step (e.g., further purification, analysis, or storage.)
: 意即使用時建議先試試看0.05M sodium phosphate + 0.15 M NaCl
: 問題來了！之前使用的buffer組成為D-PBS,本身緩衝濃度Sodium Phosphate Dibasic
: 8.10 mM, Potassium Phosphate Monobasic 1.47 mM, Sodium Chloride 138 mM
: 分離結果是看不到後面的小分子elute out
: 問題1:若改為說明書建議的配方, NaCl濃度沒差多少,而是差在緩衝溶液的濃度(50 mM)會不會
: 對於我的分離結果會有改善呢
: 問題2:我的大分子是SOD,在pH 7.4環境下應該不會帶特定電荷, 還需要這麼高（0.15M）
: 鹽類嗎？
: 由於sample快沒了 每一次的使用都盡量力求效率 請有經驗的大大指教！！！
目前用的sephadex G-25 體積是5 ml,現在我利用UV 220 可以觀察到大分子和小分子
大約分別在1.5～2.0 ml可以收集到大分子蛋白, 小分子GSH大約在3.0 ml附近可以收集到
然而為了分析蛋白質的純度,我也把小分子GSH標準品打入column去測UV 220, 並以專一測
定法測量上述1.5~2.0 ml所收集到的fraction, 結果發現這些fraction都有少許的GSH
訊號,檢討實驗手法如下：
(1)過濾採用針筒手動,流速大約控制在 1～2 ml/min,是在handbook的建議範圍內
(2)樣品體積是100 μl,直接以pipet打入column後用針筒注入buffer過濾（我看handbook
有說假如樣品不足1.5 ml(Void volume)的話會把體積補到1.5 ml後再打入column)
但是由於小分子的分子量僅400不到,一個5 ml的column大約在2 ml就收集到,這讓我懷疑
這支column的分離效率
由於蛋白質的純度對我的研究而言相當重要,原則上不希望在前述的fraction（2 ml之前）
出現。目前懷疑是(2)造成的問題。由於這支column也沒用多久,不想因為這樣就換另外
一支,不知版友們有沒有做過類似實驗可以作經驗分享,小弟感激不盡!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.1
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