Re: [求救] 有沒有人用過gel filtration???
※ 引述《premire (熱騰騰的泡麵)》之銘言：
: 小弟目前使用Hitrap desalting column進行gel filtration
: 這類columng是利用size exclution方式分離純化
: 我的inj sample是兩個分子量差距極大的protein 目的是要把大分子純化
: 但是一方面也想看看小分子多久會沖提出來
: 最近可以看到大分子很快就出來了
: 假設sample沒有和media binding 打入與column volumn同體積的buffer之內就會沖出來
: 但是結果小分子遲遲都沒有看到
: 可能的原因有：
: (1)小分子protein跑到column的media(dextran)並且binding
: (2)我的buffer條件（目前先使用含0.5 mM DTPA PBS）
: 有使用經驗的版上大大能否分享經驗呢
: 不勝感激！！！
你要把大分子和小分子的glutathione分離這樣做是對的
HiTrap 用的sephadex G-25 superfine非常常用
在常用條件下應該是不會和你的東西binding
問題可能是出在你的detection方法
如果我沒猜錯你可能是想看280nm吸收
但是glutathione雖然是一個3a.a.(中間鍵結其實不太一樣...)的peptide
但它沒有Trp Tyr Phe 這些苯環結構 所以沒有280nm吸收
如果你是做FPLC
你只能從sample buffer和desalting buffer之間的差異 看導電度或pH變化
也就是你可以配一個鹽濃度 pH值不太一樣的buffer當desalting buffer
當小分子在一個CV沖出來時 你應該會看到導電度或pH變化
前提是你不能overloading 一般來說 大約一次最多只能inject 1個CV的30%這麼多
放心 glutathione會跟原始buffer含的那些鹽類一起流出來的
(當然glutathione也是有自己的檢測assay就是了...我是沒在看啦...)
如果你是手動 那就只好自己收fraction啦 XD
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