[求救] His-tag protein 純化 無法binding

看板Biotech作者 (Zero)時間12年前 (2011/10/07 20:34), 編輯推噓2(2推 0噓 9→)
留言11則, 5人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
目前遇到與protein 純化的問題，我使用His-tag / Ni-NTA來純化，在induction 後protein有明顯的表現量，經破菌後也在supernatant中，但在之後的binding上， protein卻無法binding，大部分都在flow through中，之後的binding buffer也有 少量的protein沖出，elutein 有非常微弱的band 純化後的protein需保持其功能，不希望以Urea來denature再renature，希望各位可以提 供 一些經驗與資訊 所使用的是Rosetta菌株，用LB medium total 2L(500ml 分四瓶)以1:100放大1.5hr後 0.1 mM IPTG induce 3~4小時，之後4度C離心， 以下是我的純化方式 (用針筒自己packing) beads 5ml (reuse) 有經strip或是regeneration (兩種都無法bind) 15 ml binding buffer (5 mM imidazole) 25 ml 0.1 M NiSO4 15 ml binding buffer 10 ml sample (in binding buffer) 25 ml binding buffer 25 ml wash buffer (60 mM imidazole) wash 3 次 13 ml elution buffer (400 mM imidazole ) 每個過後的buffer都取32ul跑膠，用coomassie bleue染色flow throug和supernatant量 差不多，之後的binding buffer也有點，最後的Elution中有非常非常微弱的band... 希望各位可以提供幫助 謝謝><" -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.115.48.76
→
10/07 23:53, , 1F
elution請拉梯度
10/07 23:53, 1F
推
10/08 01:18, , 2F
flow throug是sample binding後剩下的?還是wash buf下來?
10/08 01:18, 2F
→
10/08 02:17, , 3F
elute後的beads也有跑膠 沒有band，flow through為sample
10/08 02:17, 3F
→
10/08 02:19, , 4F
binding 後所流下來的，因為flow through 和supernatant跑
10/08 02:19, 4F
→
10/08 02:22, , 5F
膠後的濃度只有一些些差異，才推測binding能力不好，clone
10/08 02:22, 5F
→
10/08 02:23, , 6F
有送定序，確實是有His-tag存在
10/08 02:23, 6F
推
10/09 03:47, , 7F
tag跟protein之間的linker弄長點試試
10/09 03:47, 7F
→
12/20 10:52, , 8F
我之前遇到和你一樣的問題，後來我更改了buffer的pH值
12/20 10:52, 8F
→
12/20 10:52, , 9F
後，protein binding 量大增，flow-through幾乎看不到
12/20 10:52, 9F
→
12/20 10:54, , 10F
signal，我把pH值從8.0調到9.5，另外我用的是0.5MCuSO4
12/20 10:54, 10F
→
12/20 10:54, , 11F
我要純化的是 EGFP protein
12/20 10:54, 11F
‣ 更多 diffa2 的文章
文章代碼(AID): #1EZl7KFe (Biotech)
‣ 更多 diffa2 的文章
文章代碼(AID): #1EZl7KFe (Biotech)