Re: [求救] 請問RNA去除genomic DNA的方法
提供一點經驗分享囉..
之前有碰過類似的問題
我們家處理的是植物樣本
TRIzol、RNAzol是完全不能抽的狀態...
(買了一瓶TRIzol放在那裡沒人用..有人想拿東西來換的話歡迎喔> <)
不過後來換到一個不錯的系統，目前是可以抽得不錯
所以樣本很重要
當然板大們說的，用途也是考慮重點
我自己的實驗有用過兩種不同的DNase
一是Ambion TURBO ←印象中是大寫？
呃，印象中這個方法還是需要37度吧..因為那是DNase的最適反應溫度
之後是用resin去做binding把酵素吃下來
通常會接酒精沉澱，可以達到很好的quality
目前聽別人的經驗談，回收率約在80%左右
但還是要看樣本特性
如果實驗上不需要small RNA
我們的另一個方式是用Fermentas的酵素搭配一種比較沒那麼貴的column
會比過CI回收率要好一些
操作上反應的時間是室溫15分鐘 (再加上過column的時間)
效果不錯，可是small RNA無法保留
以我們實驗室精打細算省錢到不行..我想這應該是目前屬一屬二省的方法
另一位板大說的跨intron這個有在報告上看到過
但為了配合primer的性質和位置
不一定剛好會有辦法跨
當然如果可以那真的一勞永逸
只是啊
像我的樣本DNA殘留嚴重會影響RNA的定量 (真的有夠難搞的啦 xD
所以真的是不處理不行了...
cDNA是可以做成雙股的
有聽說過做雙股跑膠會smear一整片
可以用smear的範圍判斷你可以作為template的大小
希望對你有幫助 > <
※ 引述《Rarelay ()》之銘言：
: ※ 引述《chiehdis (chiehhime)》之銘言：
: : 或許你可以搜尋我ID(小寫a + chiehdis) 看一下是不是類似的問題
: : 如果是的話 相關回文可以看一下 那篇作者很厲害 幫助我很多~~
: : 另外 基於如何去除gDNA又保持RNA不被降解~提供給你一些我查到的方法：
: : <<DNase>>
: : 我們家本來用Ambion Turbo ~
: : 方法是加入 enzyme 和 buffer 後 65度 incubate 30分鐘
: : 再加入inactivation reagent 4度五分鐘後離心取上清液
: : 但RNA濃度和品質受到不小影響~(我想可能是高溫的關係)
: : (但也很可能是我自己操作的失誤
: : 因為有強者同方法依舊得到超好看的電泳和數據~)
: : 改良方法
: : 1.Fermentase 37度 (較低溫) 10分鐘(縮短時間)
: : 2.Roche 室溫(較低溫) 20分鐘(縮短時間)
: : 缺點：但是以上兩者皆要過CI 步驟增加 回收量就會少~!!
: : 3.Ambion 以resin當成inactivation reagent (避免化學或熱傷害RNA)
: : http://www.ambion.com/techlib/tn/114/10.html 有原理和比較詳細的說明~
: : 缺點：聽說奇貴無比!!!!
: 其實也沒有很貴XD
: （我們是減量到一組可以用 120 rx'n，這樣一個反應在 30 元左右）
: （這個版應該可以大約的說一下價錢吧？！）
: 他的 DNA 活性很好，而且 inactivation reagent 中加有防止 RNA 降解的物質，
: 所以效果就更好了。
: : <<Kit>>
: : 1.Qiagen 的 column
: : 缺點： 較貴 且無法操作很大量~~(對我來說~因為我要的量很多!!!)
: : <<直接在抽取過程中去除DNA>>
: : 1.TRIzol v.s RNAzol
: : 這是我打去詢問一個RNA乾燥產品時 sales提供我的~ (可以跟她拿個3ml的sample試用~)
: : 和粉紅色的TRIzol不同 RNAzol是清澈的藍色液體
: : 號稱是TRIzol系列第四代~~ 不用加CI 抽完RNA也不用去DNA
: : 價錢是TRIzol的兩倍
: : 但是依我用來抽取真菌的RNA看來 是沒有DNA汙染 但Nanodrop的值很差~
: : 濃度 純度 260/230(我用來看多醣汙染) 都比TRIzol低
: 這玩意兒真的不大好用。
: : 所以就被我丟到一邊了.......
: : (聽說抽取另一種真菌和植物的quality也都不好...)
: : 缺點：貴 效果又不佳
: : 最後結果
: 不管是哪種抽取的方式，肯定會有 DNA contamination。
: 畢竟 RNA 跟 DNA 長得太像了，是絕對不可能完全分開的...
: Qiagen 的 kit 有兩種，
: 一種是加 DNase 在 matrix 上處理（當然也可以 elute 後處理）
: 另一種是配有 gDNA elimination column。
: 聽說這玩意兒的效果相當好。
: 你也可以跟 Qiagen 買配合 TRIzol 使用的 kit，
: 也可以選購 gDNA elimination column。
: 這樣你就經過兩個步驟去除 DNA contamination (TRIzol phase separation/column)
: 但這玩意兒真的是貴到...= ="
: : 後來去找了TRIzol的protocol來看 發現其實它本來就可以去除DNA了!!!
: : 我有跑過非變性電泳~(抱歉手邊沒圖 有空之後補!!)
: : 大於1kb的地方都很乾淨~~
: : 其實TRIzol可以用來抽DNA DNA在分層的地方應該會被分到有機層
: : 所以在分層提取的時候 如同之前文章版友的建議
: : 盡量不要吸取到蛋白層的部分 犧牲多一點!!!!!
: : 就可以避免掉DNA的污染了!!!
: 其實用 TRIzol 污染超嚴重的。
: 如果你有處理過原核樣品，真的是相當恐怖...
: 我自己的經驗是，就算 chloroform 加下去只取 300，
: 不轉 cDNA 直接拿 RNA sample PCR (negative control)
: 大概 35 cycles PCR 產物就飽和了...
: (25 就看的到了)
: 所以我們是有處理 Turbo DNA-free
: 而且原核樣品還加長時間處理到 1 小時。
: : 以上是我的經驗 如有錯誤 請多指教及海涵~
: : 也期望其他版友能提供建議!!
: : 希望有幫助到你 一起加油吧:)
: 做 real-time PCR 用跨 intron 的 primer set，
: gDNA 還是會被放大，
: 只是不容易變成倍增狀況而已。
: 但是這基本上是沒有人可以給你任何的保證。
: 尤其是你用 sybr green 或其他 DNA binding dye (EvaGreen, LC green... etc)
: 如果你把 primer 跨 intron，也就是你的 primer 是由兩段 exon 組成頭尾的，
: 這樣狀況會稍微好點。
: 但是還是沒辦法保證絕對不會放大出不該放大的片段。
: 所以我覺得 sample preparation 要盡力到把樣品處理到只剩下 RNA。
: 讓你的樣本越乾淨越簡單就越好。
: 接著，如果是持續偵測的基因，
: 會建議你設計跨 intron 的 TagMan probe or pNA probe，
: 避免使用 DNA binding dye。
: 如果不是持續偵測的基因（如初篩）
: 則建議你除了把 primer 設計跨 intron 外，
: 在跑完 qPCR 後用電泳膠片確認。
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※ 編輯: huuban 來自: 114.43.139.94 (09/29 01:34)
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完整討論串 (本文為第 4 之 6 篇)：