Re: [求救] 蛋白質誘導不出來!!!
※ 引述《CCDMer (Best)》之銘言：
: 各位板大好:
: 最近遇到了一個很頭痛的問題~又急著又無奈所以只能來這求救
: 我使用pET101接上的我的目標基因~用BL21(DE3)進行誘導
: 我的方式是pET101/BL21隔夜培養後, 隔天再取1CC加入到新的LB medium
: 誘導到OD=0.5~0.6 ,加入IPTG(1mM)後, 37C培養3~6小時~跑SDS-PAGE
: 降溫誘導,加入glucose這些條件,這個我都做過了,我的蛋白質約在14kDa
: 也不可能是包涵體的問題,因為我是連誘導都誘導不出來,試條件快兩個月了
: 是因為分子量小所以誘導不出來嗎? 換別株相同的pET101的clone也是無法誘導
: ,想說是不是pET101無法誘導小蛋白質~~我真的沒有辦法了~各位板大救救我好嗎?
我直接回好了，
這種蛋白表達本來就沒有一定的對或錯的方法
我看你的步驟也沒問題
我把我的經驗告訴你...
你接上 plasmid 之後不知到有沒有先定序，檢查看看有沒有 in frame
若是有 in frame
另外你是用 pet system，這裡面有隱藏版暗黑
那就是經過 transformation 後，若你分盤養個兩代或三代
也就是說你把tranformation成功的 colony 挑起來，劃在新的盤子上，然後又挑出來
養再另一個盤子上
你的 plasmid 的 promotor sequence 會被重組
亦或是你把他存成 glycerol stock，挑出來後也會被重組
廠商的菌株資料沒寫
打電話問半天，他們才吱吱嗚嗚的承認會有這樣的狀況 但是 "very seldom"
試試看把 plasmid transfrom into new BL21(DE3) 然後直接挑colony到 broth
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