Re: [求救] IHC 不太順利
※ 引述《YuDavid (討厭失眠)》之銘言：
: 發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
: 以方便板友幫您追蹤問題
: ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----
: 大家好
: 我們為了觀察CD4+細胞有沒有到特定的部位(我們的實驗是魚類的腸子)
: 選擇Immunohistochemisrty的方法
: 希望能順利追蹤到抗原
: 這幾次實驗 卻總是不太成功想請教一下大家
: 首先我們是用石蠟切片 把魚類腸道固定後
: 先deparaffinized by xylene and rehygrate
: 接下來是做Antigen Retrieval
: 這一步是我很頭痛的
: 因為查到的protocol都寫說 用Sodium Citrate buffer 浸泡後拿去加熱
: 許多人是用微波爐
: 但是我只要一加熱 可能buffer沸騰的關係 sample都會從slide上脫落
: 步知道有沒有人發生過類似的問題並且如何解決?
以antigen retrieval來說的話
用微波爐做為熱源應該是要盡量避免
因為受熱不均勻又有沸騰的問題
除了怕脫落外 buffer的濃度與pH也較容易改變
一般病理科都會買IHC專用的壓力鍋
市面上有賣專用的壓力鍋 不過那個一個好像四,五萬以上
省錢的做法就是用autoclave
如果你的機器可以選擇模式的話 要用液體模式 也就是降溫過程不會洩壓
即可到達retrival的溫度又不會使溶液沸騰 效果可以比得上壓力鍋
: 另外 我們是用DAB顯色
: 加抗體前也會用goat serum做block
: 濃度是serum/PBS=5%
: 並且一抗二抗也是用這種濃度的serum按照1:100稀釋
: DAB 則是與PBS按照1:20的比例稀世的
: 然而實驗做完後
: 細胞核透過hematoxylin染色 還蠻清楚乾淨的
: 就是沒有DAB顯色後的黃褐色出現
: 請問我實驗方法有甚麼不妥之處嗎 謝謝大家!
block最好是用與二抗同源的血清 不過有些tissue用milk即可
negative control 要用與一抗同源的血清
positive control的話 這個難說
染不出來不一定是實驗步驟的問題 很多抗體是不能拿來做IHC的
請注意你的抗體是否有註明可用
我知道sigma有專門出IHC和tissue array專用的抗體 不過也比較貴一點
這網站還有個不錯的地方 就是它會告訴你哪些tissue或cell會是positive
請去想辦法搞來當作control
DAB的話 加下去之後如果過了五分鐘還看不到明顯的黃核色
多半就不行了 放再久也會是false positive
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推
04/03 00:57, , 1F
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