Re: [求救] IHC 不太順利
※ 引述《YuDavid (討厭失眠)》之銘言：
: 發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
: 以方便板友幫您追蹤問題
: ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----
: 大家好
: 我們為了觀察CD4+細胞有沒有到特定的部位(我們的實驗是魚類的腸子)
: 選擇Immunohistochemisrty的方法
: 希望能順利追蹤到抗原
: 這幾次實驗 卻總是不太成功想請教一下大家
: 首先我們是用石蠟切片 把魚類腸道固定後
: 先deparaffinized by xylene and rehygrate
: 接下來是做Antigen Retrieval
: 這一步是我很頭痛的
: 因為查到的protocol都寫說 用Sodium Citrate buffer 浸泡後拿去加熱
: 許多人是用微波爐
: 但是我只要一加熱 可能buffer沸騰的關係 sample都會從slide上脫落
: 步知道有沒有人發生過類似的問題並且如何解決?
我之前也是這樣 有兩個方法可以試試
一個是用加壓滅菌鍋做retrival 跟滅菌一樣的溫度 5~15分鐘
一個是將slide平放 用微波爐加熱 缺點是一次只能放個幾片 因為片子不能重疊
buffer 蓋過slide再多一些(約1cm)即可 不要放太多 微波5分鐘
再不行可能就是coating的問題
: 另外 我們是用DAB顯色
: 加抗體前也會用goat serum做block
: 濃度是serum/PBS=5%
: 並且一抗二抗也是用這種濃度的serum按照1:100稀釋
我們二抗是直接用PBS稀釋
: DAB 則是與PBS按照1:20的比例稀世的
DAB是買現成溶液??
: 然而實驗做完後
: 細胞核透過hematoxylin染色 還蠻清楚乾淨的
: 就是沒有DAB顯色後的黃褐色出現
: 請問我實驗方法有甚麼不妥之處嗎 謝謝大家!
你有沒有Positive control可以試試?
你確定你的一抗一定接得到你的target protein上嗎?
一開始tissue固定太久也會影響到之後抗原抗體的反應
你要不要把你的protocol完整的PO上來呢?
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◆ From: 122.117.173.106
推
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