Re: [求救] cloning的問題
※ 引述《nidus (咕嘰)》之銘言：
: 實驗流程大略如下：
: ligation以及圖菌後
: 隔天長出colony
: 挑單一colony做cloning PCR
: 檢測是否目標基因有接進vector中
: 而我遇到的情況是cloning PCR檢測有看到目標基因被放大
: 而我將該菌珠培養O/N後 隔天抽plasmid
: 再做enzyme digestion 結果卻切不出那段基因出來
: 而且plasmid的位子好像在空的vector位子
: 送定序出來的結果也很詭異
: ps我利用vector上的CMV30為primer 定序結果不到沒有我塞進去的gene
: 序列也跟vector不同
: 請問有人遇到跟我類似的狀況嗎？？
我自己之前的實驗遇過相類似的問題
colony PCR有目標產物 大小也接近
不過作enzyme digestion卻沒做出來
再回頭抽plasmid 及再作PCR 確定目標產物有量化後
因為enzyme digestion沒結果 所以我是利用目標序列內部的primer
作了好幾組的PCR 例如目標序列全長是1500bp 那內部有的primer有的可以夾出500bp
有的可以夾出700等等 再加上全長1500bp的都有確實量化出我預期的產物
所以才比較確定應該是有接近去的 然後才送定序
而enzyme digestion作不出來有可能是實驗流程問題 也有可能是酵素問題
也有可能一些甲基化 造成那個切位酵素切不動 也有可能是個人技術問題
總之可能要一步一步檢討
但是送定序的話 如果出來的結果 卻連vector也有問題的話
考慮一下 不要只有一家廠商合作 因為有些時候是有可能有一些失誤的
之前新聞連親子親緣鑑定都有錯
當然也要檢討是否問題出在自己 送的樣品是否無污染
濃度是否足夠 有的廠商除了送plasmid 也可以送菌液請他們代為純化後再定序
另外要考量一點 因為送定序要花錢
所以最好還是能多作幾步確定有接進去東西 再去做定序
不然定序出來比對不到片段 也很囧
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