Re: [求救] transposon要做plasmid rescue
※ 引述《A65 (對!我是零食控!)》之銘言：
: ※ 引述《pocheng0227 ()》之銘言：
: : 大家好^^
: : 我最近在做tansposon的實驗 用的是Tn5的transposon 對象是細菌
: : 目前已經進行到plasmid rescue的階段 但是遇到瓶頸 想請教有經驗的高手
: : 流程大致如下:
: : 1.把細菌的genomic DNA用酵素digestion, 3hr. Heat inactivate
: : 2.ligation, O/N
: : 3.transform到DH5a (heat shock的方式)
: : 4.鋪盤(含有抗生素kanamycin)
: : 接著將盤上長出來的colony養菌, 然後抽plasmid, 可是都抽不出東西
: 長出來的菌沒先check過嗎?
請問要怎麼check啊?
Tn5 transposon含有kanamycin resistant gene,
如果能在kanamycin的盤上長的話, 是不是代表E.coli體內含有Tn5的plasmid啊?
: plasmid抽不出來是怎樣的抽不出來?
: 是沒有pellet還是跑不出東西?
有pellet, 是抽出來之後跑膠沒東西
: : (這個部分這樣做對嗎?)
: : 我發現transform, 鋪盤之後長出來的DH5a, 生長速度很慢
: ^^^^^^^ 印象中這隻長出來的很像都不大~ ^^"
: : 37度C, O/N長出來的colony很小顆, 我還多放了一天
: : 會不會有可能是污染呢?
: : 還是說digestion ligation的過程有可能出問題?
: : 感謝回答^^
: 其實這樣描述還是很難講問題出在哪~
: 感覺很像中間略過很多步驟
: 不知道你們是怎麼確定colony的?
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