Re: [求救] transposon要做plasmid rescue
※ 引述《pocheng0227 ()》之銘言：
: 大家好^^
: 我最近在做tansposon的實驗 用的是Tn5的transposon 對象是細菌
: 目前已經進行到plasmid rescue的階段 但是遇到瓶頸 想請教有經驗的高手
: 流程大致如下:
: 1.把細菌的genomic DNA用酵素digestion, 3hr. Heat inactivate
: 2.ligation, O/N
: 3.transform到DH5a (heat shock的方式)
: 4.鋪盤(含有抗生素kanamycin)
: 接著將盤上長出來的colony養菌, 然後抽plasmid, 可是都抽不出東西
: (這個部分這樣做對嗎?)
: 我發現transform, 鋪盤之後長出來的DH5a, 生長速度很慢
: 37度C, O/N長出來的colony很小顆, 我還多放了一天
: 會不會有可能是污染呢?
: 還是說digestion ligation的過程有可能出問題?
: 感謝回答^^
應該是長雜菌。你做的這個方法本來成功機率就不高吧?!
genome那麼大，而transposon只跳到一個位置，要用用酵素切又要sel-ligation
本來機率就很低，就算成功應該也只會1,2顆而已吧!
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