Re: [求救] western

看板Biotech作者sGoat (無三小羚羊)時間17年前 (2008/07/03 20:49)推噓2(2推 0噓 2→)

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※ 引述《beavet (beavet)》之銘言： : 請問跑電泳的時後 : 大家的電壓會一直往上升嗎? : 我們家是用30mV的固定電流 : 但是跑的時候發現電壓會從一開始的50左右一直往上升到200左右 : 這是常態嗎? : 有人有過這種情形嗎? 跑電泳原理是什麼呢?陰陽離子帶電荷吧... 那你長時間的跑完電泳之後不是陰陽離子聚集在正負兩極? 那你電泳溶液不就離子分布不均衡?這樣不就電阻大? 電阻大不就容易產熱?不就熱溶膠? 因為你固定電流根據歐姆定律不就要電壓上升以維持平衡? : 因為之前看到一個western的troubleshooting裡面有寫 : 造成fuzzy band的原因可能是high voltage : 但是如果試圖把電壓調低 : 因為電壓會邊跑邊往上升 : 如果電壓上不去 : 電流就會降下來 : 這樣子電流不固定結果反而不好吧? : 那請問應該怎麼改善呢...? 跑大片膠還是小片膠?大片膠通常固定電流,小片膠通常固定電壓(沒特殊情況的話) PSU固定電壓的話電壓怎麼會動?有把constant設定在V嗎? 如果以你的說法來看電壓電流都會動就很奇怪. : 另外造成smeared band的可能原因是hot gel : 請問除了在冷房跑電泳 : 還有什麼方法能夠cool down gel呢? : 冰的runnig buffer跑一個小時也是會回到室溫的吧... : 那還能怎麼辦呢...? 勤勞一點就換Buffer,懶一點就拿冰包住電泳槽. : 電流應該是造成跑電泳會熱的原因吧...? : 所以降低電流也是一個方法嗎...? 降低電流你會跑更久. : 還有difused band的原因是Excessive protein on gel : (可是那篇文章裡面沒有附圖 : 我不懂"difused band"跟"fuzzy band"有什麼不同... : 感覺都是擴散開來的樣子) difused應該是專指loading太多溢到別的lane,fuzzy是指辨識度低,毛毛糊糊揪成一團. : 之前有看到有人問過transfer出來的membrane上 : 相鄰的band會相連成一條線 (像兩個眉毛變一字眉那樣) : 請問這種現象就叫做"difused band"嗎? : 因為我也會有這種連成一條的情形 : 但是我覺得原因並不是protein太多... : 是gel沒有做好... 都是可能的原因... 但是PAGE畢竟是在溶液中進行,擴散作用是無可避免... : 因為我protein的loading量一直是固定的 : 但有時候會連成一條有時候又不會... : 不過我上下膠都已經讓它凝超過一小時了... : 我不懂還有什麼原因會造成這個現象... : 實在苦惱...唉.... : 2.transfer的問題... : 請問大家的PVDF在transfer的前置時 : 泡完MeOH就會完全親水了嗎? : 我們家是用3種transfer buffer的系統 : 處理PVDF的流程是: : MeOH 30sec 活化你的PVDF,你的PVDF說明書上有說明為何要這一步驟 : ↓ : ddwater wash × 2 洗掉MeOH(畢竟你不知道MeOH會對你PAGE造成啥影響) 另外PVDF只有在濕的狀態下才會你才能transfer : ↓ : AII buffer泡15min以上 : 我們家買的PVDF一放到MeOH裡馬上就會變成半透明的顏色沒錯 : 但是即使過了30秒甚至1分鐘 : 用水洗過後 : 還是沒辦法親水耶... : (就是在PVDF上滴buffer的時候水滴不會散開是維持一大滴的形狀) : 這樣是不對的吧? 確定一下你拿的是PVDF嗎? : coating沒有完全去掉也去不掉的樣子... : 還是大家都是這樣?? : 之後是用ECL+冷光儀照相的方式壓片 : 不知道為什麼 : membrane常常會有顏色不均勻的現象... : 四周顏色深中央顏色淺有沒有把片子壓平?看起來就像是使用影印機中間沒壓下去的樣子? 在片子後面加一張白紙或是墊厚看看(穿透式掃描機的話不能用這招) : 就是background加上上面的band 整個membrane的顏色會有漸層 : 以至於看起來一樣的loading量intensity卻不同 : 沒辦法定量...?/_\... : (需要的話晚點補圖...) : 請問這是什麼原因造成的....? : transfer沒做好? : 抗體沒hy好?? : 感謝大家有耐心的看完我的問題... : 謝謝!!!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.87.178.229

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alaric

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alaric

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sGoat

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