[求救] western
1.跑電泳的問題...
請問跑電泳的時後
大家的電壓會一直往上升嗎?
我們家是用30mV的固定電流
但是跑的時候發現電壓會從一開始的50左右 一直往上升到200左右
這是常態嗎?
有人有過這種情形嗎?
因為之前看到一個western的troubleshooting裡面有寫
造成fuzzy band的原因可能是high voltage
但是如果試圖把電壓調低
因為電壓會邊跑邊往上升
如果電壓上不去
電流就會降下來
這樣子電流不固定 結果反而不好吧?
那請問應該怎麼改善呢...?
另外造成smeared band的可能原因是hot gel
請問除了在冷房跑電泳
還有什麼方法能夠cool down gel呢?
冰的runnig buffer跑一個小時也是會回到室溫的吧...
那還能怎麼辦呢...?
電流應該是造成跑電泳會熱的原因吧...?
所以降低電流也是一個方法嗎...?
還有difused band的原因是Excessive protein on gel
(可是那篇文章裡面沒有附圖
我不懂"difused band"跟"fuzzy band"有什麼不同...
感覺都是擴散開來的樣子)
之前有看到有人問過transfer出來的membrane上
相鄰的band會相連成一條線 (像兩個眉毛變一字眉那樣)
請問這種現象就叫做"difused band"嗎?
因為我也會有這種連成一條的情形
但是我覺得原因並不是protein太多...
是gel沒有做好...
因為我protein的loading量一直是固定的
但有時候會連成一條有時候又不會...
不過我上下膠都已經讓它凝超過一小時了...
我不懂還有什麼原因會造成這個現象...
實在苦惱...唉....
2.transfer的問題...
請問大家的PVDF在transfer的前置時
泡完MeOH就會完全親水了嗎?
我們家是用3種transfer buffer的系統
處理PVDF的流程是:
MeOH 30sec
↓
ddwater wash × 2
↓
AII buffer泡15min以上
我們家買的PVDF一放到MeOH裡馬上就會變成半透明的顏色沒錯
但是即使過了30秒 甚至1分鐘
用水洗過後
還是沒辦法親水耶...
(就是在PVDF上滴buffer的時候 水滴不會散開 是維持一大滴的形狀)
這樣是不對的吧?
coating沒有完全去掉 也去不掉的樣子...
還是大家都是這樣??
之後是用ECL+冷光儀照相的方式壓片
不知道為什麼
membrane常常會有顏色不均勻的現象...
四周顏色深 中央顏色淺
就是background加上上面的band 整個membrane的顏色會有漸層
以至於看起來一樣的loading量intensity卻不同
沒辦法定量...?/_\...
(需要的話晚點補圖...)
請問這是什麼原因造成的....?
transfer沒做好?
抗體沒hy好??
感謝大家有耐心的看完我的問題...
謝謝!!!!!
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唉...不是做實驗的料...
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