Re: [求救] 請問有關PCR的問題

看板Biotech作者sGoat (無三小羚羊)時間18年前 (2008/01/17 19:29)推噓2(2推 0噓 6→)

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※ 引述《annesamuel (as)》之銘言： : ※ 引述《annesamuel (as)》之銘言： : : 我的sample跑出還的長度大約 0.5Kb : : 如果annealing temp 提高 negative control 的band就不見了 : : 但我的sample跑出來的量就非常少非常少 : : 有的sample甚至跑不出來 : : primer dimer的可能性也有考慮過 : : 也有請我學妹做結果也是一樣 : Negative control 的水是用0.2micrometer濾紙過濾再滅菌的二次水 : 引子 (primer) : Forward --- 968fgc序列： 5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG : GCG GGG GCA CGG GGG G : AACGCGAAGAACCTTAC-3’ : （with GC clamp） : Reverse ---1401r序列： 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' : primer dimer 應該不會0.5Kb 這麼大吧你的forward會形成幾個不容易解開的hairpin... reverse倒是不錯... 對於你0.5k的band我想可能是你forward的hairpin造成的... 自己黏自己就形成template跟primer了(爆) 因為你在文中有提到將溫度提高就不會出現... 但是因為你提高的溫度可能造成你reverse的primer黏不上去... 所以提高溫度的作不出來... 所以我的建議是... 如果你能確定產物哪個是你要的,而且這個過程不需要漂亮的電泳圖的話... 就挖你要的東西出來用就好了... (或是縮短anneal時間,或是加入DMSO解開二級結構,參閱5622推文的sil大) 或是將你提高anneal溫度的PCR條件增加cycle數(不要超過總數35cycle)... 再做不出來就把你P完第一次的產物稀釋5-50倍當作template再進行PCR一次... 條件跟第一次一模一樣,也是要用提高anneal溫度的條件做,當然premix都要加... 再來是龜毛的解決辦法... 將你的forward縮短,盡量使它跟reverse的條件一樣... GC值,Tm溫度,長度,其中又以Tm溫度最重要(其他作參考)... 再將設計好的primer用DNAStar或是DNAMAN這類軟體計算dimer與hairpin... 盡量取最好的一組使用... 反之...要是你的forward是不能變更的話,請加長reverse... 還有更龜毛的是你以上方法都試不出來時可以用的... 不過這個還是等你都用不出來再跟我問吧... 希望有幫上忙... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.221.60.215

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bider

01/18 00:52, , 1^F

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sGoat

01/18 09:28, , 2^F

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annesamuel

01/18 20:37, , 3^F

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