Re: [問題]關於膜蛋白的萃取
※ 引述《Nikio (工作有夠忙)》之銘言：
: 我也在做膜蛋白的純化實驗
: 用的是古早方法....打破細胞後做超高速離心
: 最後離下來有點透明的就是membrane fraction了
我們也是用這種方法~~
超高速離心是 120000g 60 min
: 不過有個小問題：
: 就是membrane fraction好像蠻難resuspense的耶
: 我用的lysis buffer是TBS+1% triton X-100，後來用到2%也有些溶不掉
: 請問版上有人做過類似實驗嗎？最後membrane fraction是用哪種東西溶掉的，感恩><
不知道你用 lysis buffer resuspension 都讓它做用多久??
我們家是用 Dodecyl-beta-maltoside(DDM) 或是 Octylglucoside(OG)
(比較常用還是 DDM 因為它的 CMC 比較小~~)
resuspension membrane 以後放在 shaker 上搖 overnight
隔天再用 50000g 30 min 去除沉澱
理論上沉澱就是 lipid 或是一些沒有被 suspension 出來的膜蛋白
不過我覺得關鍵還是在於使用的 detergent 的濃度是不是足夠了~~
然後之前有 sales 知道我們家有在做膜蛋白 然後就推薦我們用 PIERCE 的 kit
http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=06010422
可是因為我們家的系統不適用 所以就放棄了 (當然價格也是一個考量啦~)
和大家分享~~ 不知道是不是合適~~
: ※ 引述《belady (白衣天使黑心肝)》之銘言：
: : 目前我正在作這方面的實驗
: : 但材料是原核生物Gram negative bacteria
: : 方法是先破菌（ultrasonication, fresh pression我都做過）
: : 所得的crude protein在利用 ultracentrifuge進行萃取
: : 所得產物及為膜蛋白（進行SDS page後可見許多蛋白質）
: : 給你參考一下 不知道你合不合用
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寒風中的雪女無助的站著...
望著對自己捨命相救 卻將死於自己寒冷的樵夫...
樵夫憤恨的咒罵她忘恩負義...
雪女落下四百年來的第一滴淚...心中喊著：
「如果說我想愛你...
你會相信嗎?」
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