Re: [求救] 接好的plasmid切不出小片段來

看板Biotech作者meiosisLin (吽爸)時間18年前 (2007/11/30 23:55)推噓3(3推 0噓 2→)

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給妳另一種測試的方式舉例：先準備兩種菌種一個是妳Ligase inasrt之後的菌... 一個是直接transformation 空plasmid的菌在有insert的disc中取20個clone 沒有insert的dice挑一顆 clone（就是plasmid only的菌）做NC 養個3ml o/n 這20+1個菌液各取個50μl 以等體積加入phenyl/Chloroform extraction mix 離心個十分鐘 (直接把菌打破，讓DNA plasmid 都懸浮出來) 再取上層液直接跑個小於1%的膠如果有insert的話，理論上跟空plasmid來比會出現較高的Band........（就是空palsmid 和有insert的差異）再從有上飄的哪幾個clone挑出來切enzyme...... 跟PCR的方式來screen 沒有好壞之差，只是方法不同罷了給妳個建議，請慢用 ※ 引述《bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)》之銘言： : ※ 引述《foureyes ()》之銘言： : : 從九月開始就在作構築質體的動作 : : 老師要我用 PCR 夾出 insert 片段　 : : clone 到 pET32c 上面後 transform 到大腸桿菌裡面去做表現 : : 我 transform 完後在 LA plate 上有長出菌落 : : 我以為這樣就表示有接到? 因為之前曾經長不出菌落過 : : 然後挑菌落轉養後抽質體確認 : : 用與 digest 時相同的酵素 HindIII & NdeI 來切 : : 37度C 反應 2小時15分鐘 : : 跑電泳卻沒有看到理論上一大一小的片段 : : (我的小片段應該是 500 bp 左右) : : 已經重複五六次了都沒有看到小片段 : : 請問這表示我根本從頭到尾都沒接到嗎? : : 我看精華區有人說用兩種酵素的話要分一前一後處理 : : 我是兩種酵素一起加下去 : : 會是這個原因所以切不出來嗎? : : 還是有其他的問題? : : 先謝謝大家了(跪) : 阿..都重覆了5 6次了.. : 而且你digest的時間都這麼長了 : 不應該有切不出來的現象(除非你enzyme加真的很少很少..應該不可能吧) : 就相信他吧..乖乖去重新ligation一批吧.. : 有長不一定是你有接好轉進去 : 很多時候都是false positive.. : 假如你之前的都沒長colony的話 : 建議你從抽vecoter跟PCR insert這邊重新開始 : 把整個實驗都重新setup一下 : 做construct就是這樣..反正一直做不出來就從頭開始再弄一次 : 有時候就會出來了 : 我一般enzyme digest是用來做二重確認才做的 : 第一步都是用PCR screening : 直接用牙籤點一下colony然後再點一下到PCR的管子中 : 加入適當的primer跟buffer dNTP Taq..就開始做了 : (primer我會選insert的forward primer跟vector上的reverse primer) : 一次可以快速的screeningㄧ堆 : 再把screen出現positive結果的在點去養broth : 之後才用enzyme digest做第二次確認 : 大多兩種enzyem各1 ul..用於total體積20 ul : 切一小時 : 就很夠了 -- 夜生活不只是一種生活，更是一種態度，音樂有很多類型，夜店有很多種類喜歡與否只是一種偏好，卻不代表全部的選擇，夜生活的多樣與多變應該是讓人有更多更廣的眼光看生活與體驗......... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.192.165.194

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