Re: [求救] 接好的plasmid切不出小片段來

看板Biotech作者bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)時間18年前 (2007/11/30 16:06)推噓5(5推 0噓 3→)

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※ 引述《foureyes ()》之銘言： : 從九月開始就在作構築質體的動作 : 老師要我用 PCR 夾出 insert 片段　 : clone 到 pET32c 上面後 transform 到大腸桿菌裡面去做表現 : 我 transform 完後在 LA plate 上有長出菌落 : 我以為這樣就表示有接到? 因為之前曾經長不出菌落過 : 然後挑菌落轉養後抽質體確認 : 用與 digest 時相同的酵素 HindIII & NdeI 來切 : 37度C 反應 2小時15分鐘 : 跑電泳卻沒有看到理論上一大一小的片段 : (我的小片段應該是 500 bp 左右) : 已經重複五六次了都沒有看到小片段 : 請問這表示我根本從頭到尾都沒接到嗎? : 我看精華區有人說用兩種酵素的話要分一前一後處理 : 我是兩種酵素一起加下去 : 會是這個原因所以切不出來嗎? : 還是有其他的問題? : 先謝謝大家了(跪) 阿..都重覆了5 6次了.. 而且你digest的時間都這麼長了不應該有切不出來的現象(除非你enzyme加真的很少很少..應該不可能吧) 就相信他吧..乖乖去重新ligation一批吧.. 有長不一定是你有接好轉進去很多時候都是false positive.. 假如你之前的都沒長colony的話建議你從抽vecoter跟PCR insert這邊重新開始把整個實驗都重新setup一下做construct就是這樣..反正一直做不出來就從頭開始再弄一次有時候就會出來了我一般enzyme digest是用來做二重確認才做的第一步都是用PCR screening 直接用牙籤點一下colony然後再點一下到PCR的管子中加入適當的primer跟buffer dNTP Taq..就開始做了 (primer我會選insert的forward primer跟vector上的reverse primer) 一次可以快速的screeningㄧ堆再把screen出現positive結果的在點去養broth 之後才用enzyme digest做第二次確認大多兩種enzyem各1 ul..用於total體積20 ul 切一小時就很夠了 -- 啊！我們真的是拼圖(喘) ╭╮ ˊ ┌──┬┘└┐ ╭┘ ╭┘ │ ╰┐╭╮┐╭╮│)) └┘└┴┘└┘ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.57.139

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