Re: [求救] 想請教immunofluorescence的一些操作問題
※ 引述《iamprada (熊寶)》之銘言：
: 大大您好，最近也在做這個實驗
: 過程中也碰到許多問題 有些也與您相似!
: 例如:我對於固定液的使用有許多的疑慮~
: 就我所知~固定液常用的有三種
: 1. -20度C 100% MeOH
: 2. acetone
: 3. 4% Paraformaldehyde
: 但對於要選用何種固定液實在很難抉擇
: 我有試著測試1&3的方法
: 但似乎很難從染色結果中推論誰好誰壞!
: 若要從顯微鏡下觀察細胞型態 卻沒有太大差異
: 請問以各位大大的經驗 該如何選擇呢?(Paper似乎也沒特定用者)
: 而我想看的蛋白是細胞膜上的receptor
大大您好
對於使用methanol和PFA之間的差別
根據學長對我的說明
就是methanol除了可以fix cell之外
methanol同時也會"extracts" the soluable pool並且permeablize lipid membrane
而PFA就單純是fix cell的作用
所以若使用PFA來固定細胞的話 就必須使用一些detergent來permeablize membrane
針對一些membrane pool的protein 學長是建議"別"使用methanol來固定細胞
因為它會wash掉部份protein
希望對你有幫助^^
: 另外好像許多人會將blocking buffer 或是抗體用PBST配置
: 但我有個顧慮是Tween-20或是tritonX-100
: 是不是會破壞我主要觀察的membrane protein?
: 因此我permeablizing改用0.5% saponin 抗體則配置在PBS中~
: 請問我這樣的顧慮是有必要的嗎~?
: 麻煩各位大大指教!!
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10/28 17:52, , 1F
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