[問題] pGEM不是應該很好接的嗎~!?
我是用Promega 的 pGEM-T easy Vector system
我要的片段在之前已經利用上面提到東西接起來了~3k vector+1k insert
現在要利用PCR~來換我insert兩端的切位~
又因為~我的template是pGEM
所以為了防止transform後被原來的template干擾~
我PCR完的產物~利用Gel-M~來做gel elution
才依Promega提供的那本小手冊的量去加入pGEM vector
混合好後~放在4度C overnight
隔天transform是用300λ的competent cell (TSS方法製成)
盤子上塗 Amp.(50mg/ml) 30λ + X-gal (4%)20λ + IPTG 15λ (100mM)
問題來了~~
1.收盤子的時候
居然一盤只有不到五顆的colony
2.挑出來養~抽plasmid去跑膠~
結果很神奇的是大約在2k左右的大小~
我的盤子~看起來沒有長雜菌
所以理論上挑去養的~
要不就是要在3k
要不就是要在3k+1k
和學長討論加上自己查一些資料的結果~
已經討論出一些原因~
1. ligation的效率不好~
我去promega的網站查~它是說要在22度下16hr
可是promega的小冊子又說放在4度下overnight
T4-ligase適合的工作溫度到底是多少呀~!?
之前在做cloning的時候~我是都放在16度的水浴
2. 學長說有可能Insert的量經過elution後變的太少
可是我在elution後~會習慣拿2λ去跑膠~
經過我計算的結果~大約都還有60~45ng/λ
3. 神奇的2k(是很sharp的band喔)
目前還不知道它是什麼~
另一個學長說有可能是我的competent cell被實驗室其他抗Amp的菌汙染了~
可是我們實驗室~沒有2k抗Amp的plasmid呀~!?
4. Amp塗太多~!?
我目前設定的解決方式~~
1. PCR的產物~在gel elution後~直接加限制酶去切~
overnight後~過PCR-M
直接接進我要用的pCAMBIA1304
2. 加入pGEM後~放在4度下讓它接兩天~
3. 加入pGEM後~放在22度下讓它overnight
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大家可以幫我再想想問題可能出在哪嗎~!?
或是有什麼解決的方法~!?
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08/14 09:45, , 1F
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