Re: [問題] pull-down與IP的討論
※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之銘言：
: 謝謝這位版友的回答
: 看了之後才發現我把實驗想得簡單了....
: 不過有些問題希望可以跟大家討論一下
: : 要注意的是，
: : 在GST-pull down裡面，
: : 你的A protein和B protein的"量"相較於"正常情況"下，
: : 其實是呈現overexpress的狀態;
: : 而protein-protein間的interaction是與protein的濃度有關係的，
: : 在濃度高的時候，
: : non-specific binding就有可能發生...
: : 所以A和B或許在in vivo並沒有interaction，
: : 但是在GST-pull down或是yeast-two hybrid的實驗中，
: : 由於他們被"overexpress"了，就發生了平常不會發生的interaction...
: 關於濃度的問題 我有考慮過
: 但是在進行GST-pull-down時 利用wash buffer wash的過程中
: 不知道能不能視為一種dilute 假若可以的話
: 那麼基本上GST pull-down做出來的結果應該都是可信的
: 除非 兩個protein的大小太過於懸殊
: 導致可能小蛋白會沉積在大蛋白上造成fale positive
基本上，in vitro pull down assay是很可信的
其結果下的結論"A protein can interact with B in vitro"
A和B在structure上有可以互相interact的region(這邊大家都會搞一堆deletion clone
去narrow down interactive region)
不過in vitro畢竟不能推到in vivo
誠如上篇大大說的
在細胞內有太多因素要考慮
嗯嗯
實驗上，要先證明in vivo in the same complex再證明 in vitro direct interaction
比反過來先證明direct interaction再證明in vivo簡單且明確的多
: : 除了實驗情境，這裡還要考慮到幾個問題:
: : 1. A和B會不會在這個cell裡面碰頭?
: : 2. 如果會，那有A的地方一定會有B嗎?
: : 3. A和B在這個cell裡面的量有多少?
: : 4. 有可能很倒楣的，antibody認的epitope剛好在A和B interact的區域。
: : 關於問題1，或許A和B有interact的"潛力"，
: : 但要是A和B在這個cell裡面完全不會被表現在同一個區域...
: : 就算有潛力，終究還是不會發生interaction...
: 其餘恕刪
: 這個問題其實有點怪
: 因為在進行IP的時候 都會將cell lysis
: 之後利用cell lysate做IP
: 如此 假設A與B在cell 裡面八竿子打不著
: 但是不知道為什麼他們在in vitro就是會有interaction
: 那麼 利用immunoflourence的方法可以知道這兩個protein會在不同的位置
: 但是 用cell lysate的話 因為細胞都被打破了
: 原本維持兩個protein在特定位置的因素就消失了
: 意思就是幾乎等於是in vitro的test
: 如此所測出來的 應該也是跟GST pull-down的結果一樣
lyse cell後做CoIP
condition也許有點類似in vitro
但莫要忘了pull down通常都是兩個purified protein在作用
cell lysate有一狗票protein complex在你的solution中漂啊漂啊
在下面情況你說因為大家一起漂來漂去所以原本不會在一起的AB在一起了
機率不是沒有，但量一定是很低的
如果是form the complex或是AB本來就associate在一起
在量上就差很多
所以之後實驗者還會佐以其他實驗證明(like immunostain, gradient fraction...等)
: (假設兩protein expression level 相等 且epitope不在interaction reion)
: 有些想法 希望跟大家討論一下XD
這個問題我之前也想了一段時間
這其實是一個cellbio v.s biochem experiment的有趣對比
biochem常常把cell搞破後研究
去回推細胞中真實的情形
所以有人當然不滿意，希望直接看到活細胞中分子的情況
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