Re: [問題] pull-down與IP的討論
謝謝這位版友的回答
看了之後才發現我把實驗想得簡單了....
不過有些問題希望可以跟大家討論一下
: 要注意的是，
: 在GST-pull down裡面，
: 你的A protein和B protein的"量"相較於"正常情況"下，
: 其實是呈現overexpress的狀態;
: 而protein-protein間的interaction是與protein的濃度有關係的，
: 在濃度高的時候，
: non-specific binding就有可能發生...
: 所以A和B或許在in vivo並沒有interaction，
: 但是在GST-pull down或是yeast-two hybrid的實驗中，
: 由於他們被"overexpress"了，就發生了平常不會發生的interaction...
關於濃度的問題 我有考慮過
但是在進行GST-pull-down時 利用wash buffer wash的過程中
不知道能不能視為一種dilute 假若可以的話
那麼基本上GST pull-down做出來的結果應該都是可信的
除非 兩個protein的大小太過於懸殊
導致可能小蛋白會沉積在大蛋白上造成fale positive
: : 但是剛剛利用IP卻發現他們之間沒有interaction?
: 除了實驗情境，這裡還要考慮到幾個問題:
: 1. A和B會不會在這個cell裡面碰頭?
: 2. 如果會，那有A的地方一定會有B嗎?
: 3. A和B在這個cell裡面的量有多少?
: 4. 有可能很倒楣的，antibody認的epitope剛好在A和B interact的區域。
: 關於問題1，或許A和B有interact的"潛力"，
: 但要是A和B在這個cell裡面完全不會被表現在同一個區域...
: 就算有潛力，終究還是不會發生interaction...
其餘恕刪
這個問題其實有點怪
因為在進行IP的時候 都會將cell lysis
之後利用cell lysate做IP
如此 假設A與B在cell 裡面八竿子打不著
但是不知道為什麼他們在in vitro就是會有interaction
那麼 利用immunoflourence的方法可以知道這兩個protein會在不同的位置
但是 用cell lysate的話 因為細胞都被打破了
原本維持兩個protein在特定位置的因素就消失了
意思就是幾乎等於是in vitro的test
如此所測出來的 應該也是跟GST pull-down的結果一樣
(假設兩protein expression level 相等 且epitope不在interaction reion)
有些想法 希望跟大家討論一下XD
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