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作者 a90648 在 PTT [ Biotech ] 看板的留言(推文), 共424則

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Re: [求救] WB internal control 定量問題

[ Biotech ]11 留言, 推噓總分: +2

作者: Ianthegood - 發表於 2017/03/07 18:43(7年前)

6^F→a90648: 根據取的組織量，用的lysis biffer的量來判斷load的量03/07 19:36

7^F→a90648: 一般是不至於會load到control爆表的量啦!!03/07 19:37

Re: [求救] WB internal control 定量問題

[ Biotech ]114 留言, 推噓總分: +1

作者: tz2733 - 發表於 2017/03/07 17:47(7年前)

1^F→a90648: 1.但是大家都是1:2變1:1.8 對相對定量來說不影響03/07 18:10

26^F→a90648: http://imgur.com/4OI69Bw 舉個例子03/07 21:31

27^F→a90648: 有錯的話，麻煩幫忙修正一下謝謝03/07 21:31

29^F→a90648: 謝謝b大指正，修改好囉!! http://imgur.com/Jis7xxa03/07 21:49

30^F→a90648: 暈了= = 這次變打錯符號... http://imgur.com/qOnjGgA03/07 21:52

31^F→a90648: 邊吃飯邊弄一直修錯QQ http://imgur.com/Sp4xvfG03/07 22:04

46^F→a90648: 可用的internal control就是可以忠實的反映loading蛋白量03/08 00:46

47^F→a90648: 蛋白濃度高internal control就多反之亦然03/08 00:46

51^F→a90648: 忽然想到!! 現在的問題會不會是t大沒弄清楚他所說的03/08 00:58

52^F→a90648: 特定蛋白再除以internal control得到ratio值03/08 00:59

53^F→a90648: 這個步驟所代表的意義是甚麼?03/08 00:59

54^F→a90648: 再用同體積lysis buffer收蛋白的情形下細胞多蛋白就多03/08 09:54

55^F→a90648: 而在用不同體積收蛋白的情形下，濃度高，control也會高03/08 09:57

56^F→a90648: 不論是訂濃度跑還是訂control再跑一次，你所使用的control03/08 09:58

57^F→a90648: 一定要是穩定不受影響的，這是一定要遵守的條件03/08 09:59

58^F→a90648: 取同樣量的蛋白但跑出的control卻差很多03/08 10:00

59^F→a90648: 這個control就不能用03/08 10:01

60^F→a90648: 而後定法就是利用internal control作normalization03/08 10:02

61^F→a90648: 但是這方法至少要多跑一次膠，也要注意band是否過曝之類的03/08 10:03

62^F→a90648: 相對於一開始就測濃度要注意的地方更多更麻煩03/08 10:04

63^F→a90648: 我也是一開始就乖乖測濃度去跑就好了03/08 10:04

64^F→a90648: 但不代表這樣做就是錯的03/08 10:05

65^F→a90648: 而且是原PO家的助理不是原PO這樣做啊XD03/08 10:08

79^F→a90648: 依internal control去回推調整sample loading量03/08 15:12

80^F→a90648: 就是你所說的normalization阿!! 只是前定量是計算出數值03/08 15:13

81^F→a90648: 而後定試是反映到loading量去實際有動作的調整03/08 15:14

82^F→a90648: 而在前定量出現甲不一致改用乙計算時03/08 15:15

83^F→a90648: 後定量當然也是要跟著用乙阿!! routine的實驗中哪個03/08 15:16

84^F→a90648: control可用這是已知的是，前後定量不會有差異03/08 15:17

85^F→a90648: 但在第一次做實驗時，一定會看複數個control才能知道03/08 15:18

86^F→a90648: 你舉的同次曝光時間不同造成的差異，當1:2變成1:1.8時03/08 23:52

87^F→a90648: 代表已經過曝啦請降低曝光時間03/08 23:53

88^F→a90648: 至於我舉的例子為什麼要跑第二次，第一次的結果03/08 23:53

89^F→a90648: control粗細差了兩倍，雖然相對定量的結果不會變03/08 23:54

90^F→a90648: 但是請問投paper時會放這種圖嗎?03/08 23:54

91^F→a90648: 至於你提到的那篇的第4.2最後兩行就是再說後定法囉03/09 00:04

92^F→a90648: 但就如前面大家提到的，internal control的選擇是很重要的03/09 00:05

93^F→a90648: 當然裡面提到用Coomassie staining去看loading是否準確03/09 00:06

94^F→a90648: 也是可以的03/09 00:06

95^F→a90648: 雖然裡面是說去確認測的蛋白濃度是否準卻03/09 00:08

96^F→a90648: 而後定法就是類似的作法只是少了一開始的測量濃度03/09 00:09

97^F→a90648: 基本上該說的大家也說得差不多了，而原PO也說了兩種做法03/09 00:12

98^F→a90648: 得到的結果是差不多的，後定法是否真的有問題03/09 00:13

99^F→a90648: 就讓大家自己做判斷了03/09 00:13

112^F→a90648: internal control的定義就是他可以反映loading的蛋白量阿03/12 02:20

113^F→a90648: 在使用的internal control沒問題的情形03/12 02:21

114^F→a90648: 定loading量和定internal control是一樣的事情03/12 02:22

Re: [求救] WB internal control 定量問題

[ Biotech ]28 留言, 推噓總分: +6

作者: yvette26 - 發表於 2017/03/06 23:09(7年前)

1^F→a90648: internal control會有變化的話就不能這當internal control03/06 13:52

23^F→a90648: internal control就是會跟著你的組織量多就多少就少03/06 23:23

24^F→a90648: 才叫做internal control啊!03/06 23:23

25^F推a90648: 舉個例子semi-qPCR 不就是跑膠根據 internal control03/06 23:29

26^F→a90648: band的強弱進行調整嗎?03/06 23:29

27^F→a90648: 照你的說法，以前paper上用semi-q的都有問題囉?03/06 23:31

30^F→a90648: 沒錯!! 能這樣做的前提就是在這邊03/06 23:51

36^F→a90648: 這算是很嚴謹的做法啦XD03/06 23:54

39^F→a90648: semi-q 簡單來說就是cDNA pcr完之後跑膠,根據internal con03/07 09:09

40^F→a90648: trol的強弱來調整pcr cycle數，將大家internal control調03/07 09:09

41^F→a90648: 成一樣強來比較target gene表現量的多寡03/07 09:09

47^F→a90648: 基本上該說的大家也說得差不多了，而原PO也說了兩種做法03/09 00:10

48^F→a90648: 得到的結果是差不多的，後定法是否真的有問題03/09 00:11

49^F→a90648: 就讓大家自己做判斷了03/09 00:11

50^F→a90648: = = 推錯篇...03/09 00:12

[求救] WB internal control 定量問題

[ Biotech ]44 留言, 推噓總分: +8

作者: yvette26 - 發表於 2017/03/06 13:50(7年前)

1^F→a90648: internal control會有變化的話就不能這當internal control03/06 13:52

24^F→a90648: 但是圖片反映的是蛋白的量阿!哪有不同?03/06 23:19

25^F→a90648: 那照你的說法qPCR不就定螢光強度和定RNA量的差異?03/06 23:20

38^F→a90648: 所以在使用的internal control沒問題的狀況下03/07 20:18

39^F→a90648: 圖片就代表蛋白量啦03/07 20:18

H2O2吸光度下降實驗

[ Biotech ]1 留言, 推噓總分: 0

作者: xy234786 - 發表於 2017/03/04 00:21(7年前)

1^F→a90648: 估狗不是可以找到不少kit嗎?03/04 00:36

不同dish下藥後沒效果

[ Biotech ]44 留言, 推噓總分: +5

作者: knowledge265 - 發表於 2017/02/27 14:54(7年前)

1^F→a90648: 劑量是指除了medium又分別加加了1,3,8 ml的藥進去?02/27 15:10

4^F→a90648: 嗯!! 知道了那藥的stock濃度是多少呢02/27 17:15

5^F→a90648: 加藥的方式是用medium稀釋藥物最後總體積是8ml02/27 17:17

6^F→a90648: 還是8ml medium再加入藥物進去?02/27 17:18

12^F→a90648: 依照目前敘述只能推測是不是藥壞了?02/27 18:21

[討論] Real-time PCR的電泳產物

[ Biotech ]37 留言, 推噓總分: +7

作者: bbbnick - 發表於 2017/02/15 16:19(7年前)

2^F→a90648: 待測物膠的band跟PC比強弱如何? melting curve有訊號嗎?02/15 17:30

8^F→a90648: 看來待測物的量應該不少，會不是會訊號太強被濾掉了?02/16 11:15

9^F→a90648: 我曾經遇過ct只有2~3，roche nano軟體直接濾掉沒data02/16 11:17

10^F→a90648: 後來調了exclude early cycle的值data就出來了02/16 11:19

11^F→a90648: 不過挼果真是這種情狀我會建議dilute DNA後再跑一次02/16 11:20

12^F→a90648: 不過我是用SYBR 不確定probe system會不會有太強的問題02/16 11:24

13^F→a90648: 如果是這樣的話感覺是primer P到的不是probe bind的地方02/16 16:40

14^F→a90648: 那定序出來應該PC和待測物結果會不一樣02/16 16:41

18^F→a90648: 有qPCR signal的圖和膠圖嗎?02/23 16:38

22^F→a90648: 圖看起來頗正常的阿@@ 還是改用SYBR試試?02/24 11:52

33^F→a90648: 他有說sequence結果是一樣的東西了02/28 15:56

34^F→a90648: 會不會就是因為中間那幾個鹼基是probe binding site03/01 11:49

35^F→a90648: 所以導致待測物沒訊號?03/01 11:50

[求救] dengue virus 2好壓的抗體

[ Biotech ]15 留言, 推噓總分: +2

作者: virusgg - 發表於 2017/01/18 11:42(7年前)

8^F→a90648: 你的意思是sample沒煮過就跑膠了?01/18 23:09

細胞存活率實驗問題

[ Biotech ]8 留言, 推噓總分: +1

作者: s9527543 - 發表於 2017/01/12 14:24(7年前)

4^F→a90648: 藥會失效就看要12或24小時換一次含藥的medium阿01/12 17:51

5^F→a90648: 直接提高劑量那低濃度的效果不就沒data?01/12 17:53

[求救] Transfection 的問題

[ Biotech ]18 留言, 推噓總分: +1

作者: whatupmen - 發表於 2016/12/09 00:52(7年前)

7^F→a90648: 你就想想水和tris要多少才會造成細胞毒性？12/09 12:59

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