[討論] Real-time PCR的電泳產物

看板Biotech作者 (Nick)時間7年前 (2017/02/15 16:19), 7年前編輯推噓7(7推 0噓 30→)
留言37則, 8人參與, 最新討論串1/1
有個實驗問題想要請教一下版友~ 最近做一些以Real-time PCR的同一類型的成分分析 (以Kit驗) 結果: 1. Inhibition全部皆無抑制現像 (正常，Ct值無異常) 2. Reaction中NTC、NC如預期沒有訊號(X)，PC有訊號(O)，待測物無訊號(X) 一時興起將產物拿去跑電泳， 結果:NTC、NC無任何條帶，PC、待測物在同一個位置皆有一個乾淨的放大產物(~約150bps) 如果今天Real-time PCR有任何問題，Inhibition皆無任何抑制現像，且PC有明顯訊號 可是電泳結果又很奇怪，PC及待測物有單一產物，但待測物於real-time PCR無訊號 請問何解? @@ PS: 將該待測物拿去驗ELISA有檢出蛋白質。 (表示含該成分相關蛋白質) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 211.75.95.2 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1487146793.A.B62.html
→
02/15 17:10, , 1F
待測物是什麼
02/15 17:10, 1F
待測物是食品樣本，要鑑定裡面的成分
→
02/15 17:30, , 2F
待測物膠的band跟PC比強弱如何? melting curve有訊號嗎?
02/15 17:30, 2F
kit的PC強度較待測物弱很多，但還是看得到清楚的band， 方法是probe-based real-time PCR
推
02/15 18:53, , 3F
定序啊
02/15 18:53, 3F
今天將PCR產物送定序了 XD
→
02/15 22:13, , 4F
你是用probe還是SYBR?再設計一對primer?
02/15 22:13, 4F
Probe-based real-time PCR喔! 因為kit是commercial kit，無法得知用的primer序列， 而且也不知道針對標的物的哪段基因，只知道針對該成分的ITS1基因 ※ 編輯: bbbnick (114.39.176.167), 02/15/2017 23:54:54
→
02/16 01:26, , 5F
可以自己設計，自己合primer，不算貴
02/16 01:26, 5F
→
02/16 01:27, , 6F
有軟體可以用，我覺得roche的系統都不錯
02/16 01:27, 6F
推
02/16 02:04, , 7F
一個lane跑沒跑pcr 純的待測物看看
02/16 02:04, 7F
→
02/16 11:15, , 8F
看來待測物的量應該不少，會不是會訊號太強被濾掉了?
02/16 11:15, 8F
→
02/16 11:17, , 9F
我曾經遇過ct只有2~3，roche nano軟體直接濾掉沒data
02/16 11:17, 9F
→
02/16 11:19, , 10F
後來調了exclude early cycle的值data就出來了
02/16 11:19, 10F
→
02/16 11:20, , 11F
不過挼果真是這種情狀我會建議dilute DNA後再跑一次
02/16 11:20, 11F
→
02/16 11:24, , 12F
不過我是用SYBR 不確定probe system會不會有太強的問題
02/16 11:24, 12F
謝謝您的建議，今天試了稀釋兩個稀釋倍率，Ct值與NTC、NC一樣仍然是沒有訊號Orz... 看來我先等定序的結果好了~ ※ 編輯: bbbnick (211.75.95.2), 02/16/2017 16:33:45
→
02/16 16:40, , 13F
如果是這樣的話感覺是primer P到的不是probe bind的地方
02/16 16:40, 13F
→
02/16 16:41, , 14F
那定序出來應該PC和待測物結果會不一樣
02/16 16:41, 14F
可是電泳結果PC、待測物的擴增產物size一樣 XD 怪怪的 就等定序出來再看看~ 謝謝囉! ※ 編輯: bbbnick (211.75.95.2), 02/17/2017 14:39:46
推
02/19 16:58, , 15F
請問定序結果如何？應該出來了吧，我也很好奇
02/19 16:58, 15F
→
02/21 08:36, , 16F
還沒耶 XD
02/21 08:36, 16F
→
02/23 16:10, , 17F
定序出來了，PC與Sample一樣，不知道為什麼沒訊號@@
02/23 16:10, 17F
→
02/23 16:38, , 18F
有qPCR signal的圖和膠圖嗎?
02/23 16:38, 18F
→
02/24 09:18, , 19F
02/24 09:18, 19F
→
02/24 09:29, , 20F
02/24 09:29, 20F
→
02/24 09:29, , 21F
REF是同類型的參考物質 (理論上與PC同)
02/24 09:29, 21F
→
02/24 11:52, , 22F
圖看起來頗正常的阿@@ 還是改用SYBR試試?
02/24 11:52, 22F
→
02/24 15:01, , 23F
a大謝謝您喔! 我有機會再試試看 @@
02/24 15:01, 23F
推
02/25 01:12, , 24F
好奇定序結果XD
02/25 01:12, 24F
定序結果出來了喔 REF(參考物質)與待測物序列相似度99% (只有中間幾個鹼基不同)
推
02/27 23:30, , 25F
kit放多久了 我推測是probe壞了 從qPCR amp plot看curve
02/27 23:30, 25F
Kit還有半年效期，且Kit的PC沒問題 @@
→
02/27 23:32, , 26F
理論上pc/sample應該是要跟ref平行比較合理吧
02/27 23:32, 26F
→
02/27 23:33, , 27F
不過也可能是根本P出奇怪的片段 即使跑出來band一樣 但
02/27 23:33, 27F
→
02/27 23:34, , 28F
主要amplified產物並不是目標產物 所以probe可能hy得到
02/27 23:34, 28F
→
02/27 23:35, , 29F
PC/ref 卻hy不到samples 可以試著用那組primer配sybr
02/27 23:35, 29F
→
02/27 23:35, , 30F
green跑看看 然後看melting curve 是否產物Tm不同
02/27 23:35, 30F
→
02/27 23:37, , 31F
sequence出來 PC和sample一樣都沒訊號 很可能就是主產物
02/27 23:37, 31F
→
02/27 23:37, , 32F
根本不是你想要amplify的片段
02/27 23:37, 32F
有機會會用SYBR試試...
→
02/28 15:56, , 33F
他有說sequence結果是一樣的東西了
02/28 15:56, 33F
※ 編輯: bbbnick (220.130.231.117), 03/01/2017 09:31:13
→
03/01 11:49, , 34F
會不會就是因為中間那幾個鹼基是probe binding site
03/01 11:49, 34F
→
03/01 11:50, , 35F
所以導致待測物沒訊號?
03/01 11:50, 35F
推
03/02 18:04, , 36F
不是吧 taqman做在3'端 貼不上去就沒訊號不是?
03/02 18:04, 36F
推
03/02 18:06, , 37F
搞不好你的well掛了XD 換個well跑跑看
03/02 18:06, 37F
‣ 更多 bbbnick 的文章
文章代碼(AID): #1Of0yfjY (Biotech)