Re: [新聞] 北榮團隊兩天驗完五千檢體 靠「Pooling」首次在台建功
本來只想簡單推個文就好的，不知不覺愈打愈多就乾脆整理整理打完整一點發個一篇好了
，順便解釋一下前陣子大家鬧得沸沸揚揚的機器問題。
1. 名詞解釋
1.1 特異性、真陰性率(Specificity, sp)：判斷為陰性且實際為陰性的比率。
1.2 靈敏度、真陽性率(Sensitivity, sn)：判斷為陽性且實際為陽性的比率。
1.3 定性(Qualitative)：結果以陽性(+)或陰性(-)顯示待測物的有無。
1.4 定量(Quantitative)：藉由與標準品進行比對，可換算出待測物的數量。
2. PCR
2.1 傳統PCR
藉由準確的溫度升降來擴增目標核酸序列，透過跑膠來看結果。
2.1.1 優點：其實也沒什麼優點，不過發paper放膠圖看結果最straightforward。
2.1.2 缺點：速度慢、要碰有毒的EtBr、照UV光、這種大體積buffer的實驗容易搞得
bench濕答答的我不喜歡。
2.2 Real-time PCR (Quantitative PCR)
和2.1一樣也是藉由準確的溫度升降來擴增目標核酸序列，每跑完一個循環機器會即
時偵測反應後的螢光，若原始的目標核酸序列量愈多(也就是病毒量愈多)，則幾個循
環後機器就能偵測到螢光，CT值就愈低；反之，若原始的目標核酸序列量愈少，則
要經過好幾個循環機器才能偵測到螢光，CT值就愈高。這種PCR會同時搭配6~8個標準
品(通常是10^8或10^6序列稀釋到10^1)一起上機，所以可以藉由看待測樣品的CT值落
在標準品的哪個區間來了解待測樣品的濃度，也是目前各國用來確診的標準。
2.2.1 優點：可用來準確測量待測樣品的濃度。
2.2.2 缺點：速度慢、標準品若沒稀釋好(R^2值太差)則整組實驗fail。
2.3 快速PCR
這類PCR大多使用自動化設備，採用機械手臂進行操作，可以大幅減少人為的誤差以
及可同時大量上機，也有適用於小型診所及家庭的POCT儀器，國內外已有許多上市的
機器[1]，使用的方法及原理不盡相同，有的能定量，有的只能定性。
2.3.1 原理舉其中一種恆溫式為例就好，實在有點懶得寫太多。此方法未經過準確的溫
度循環過程，無法明確知道目標核酸於反應時間內擴增了多少數量，且通常不會
搭配標準品，故僅能定性，不能定量，簡單舉兩個例子，例如：
2.3.1.2 恆溫環形核酸增幅法(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)
藉由引子於60-65℃的恆溫中將雙股DNA denature成單股DNA[2-4]。
2.3.1.2.1 優點：在DNA extension的過程中會釋出pyrophosphate，與試劑中的鎂離
子形成magnesium pyrophosphate，生成白色沈澱物，可藉由肉眼判斷陰陽
性[3]。
2.3.1.2.2 缺點：primer及probe較難設計且限制多，在非目標序列上也易有非專一性
的擴增導致偽陽性發生[3, 5]。
2.3.2.2 熱對流PCR
https://i.imgur.com/hV7xLSk.jpg
原理是利用Rayleigh–Bénard對流，在封閉式的反應毛細管中藉由加熱反應
管底部的金屬環，使下方的溫度高於毛細管上方，形成熱對流，讓核酸在下方
進行denature，接著往上漂至上方時進行引子annealing，往下漂至中段時進
行extension[6-7]，核酸在固定的時間內於恆溫環境中不停地循環上述步驟，
藉由分別偵測實驗前及實驗後的螢光值，利用軟體來判讀目標核酸序列的有無
。國內也已有商業化應用此法的政府法人及業者[1, 8-10]，在前陣子許多討
論PCR的文中屢次被提及的iiPCR即為此種之延伸。
2.3.2.2.1 優點：相較於傳統的PCR，恆溫式的方法省去了溫度升降循環的時間，所以
速度較快。
2.3.2.2.2 缺點：因為此種核酸擴增法是利用熱對流的方式讓核酸自行在反應管的不
同溫度梯度位置中進行denature、annealing以及extension，但你無法精
確地掌控每段序列增幅了多長(完整性)以及引子與核酸在該溫度下的反應
效率，所以實驗結果嘛……有時候會跳，也就是說此種方法相較於特異性
，它的靈敏度稍差，偶爾還是不可避免地會有偽陰性出現，這是這種系統
的問題，目前尚無解，至於頻率嘛……我手上現在也沒有數據，但給我raw
data的話這是可以整理統計出來的，總之，此法偽陰性的比率比抗原快篩
低，比qPCR高。
3. Pooling test
https://i.imgur.com/2P6aIPb.jpg
Pooling test適合用來找出抗原快篩中的偽陰性，如圖所示，將抗原快篩陰性的檢體以
上圖的方式分組，用快速PCR進行pooling test，我們可以在第1、7、C、F組的樣本中
得到訊號，此訊號可能來自C1、C7、F1、F7，再拿這四個檢體去做qPCR就能得知確診的
是C1和F7，並且將C7和F1排除[11]。請問是一開始就拿這100個抗原快篩陰性的檢體直
接去做qPCR找出兩個偽陰性比較有效率，還是先依上圖模式做20個快速PCR再做4個qPCR
找出兩個偽陰性比較有效率？尤其是當你有幾萬個檢體要驗的時候。至於樣本稀釋的問
題，10個sample一起驗的話大約差3~5個cycle，反正pooling只是先定性(第1、7、C、F
組有訊號)，最後再把疑似的檢體(C1、C7、F1、F7)拿去做qPCR定量就好了。
流程圖：
https://i.imgur.com/9528Aev.jpg
4. 機器
機器的部分，這種用來檢驗疾病的儀器和試劑都要取得IVD (In vitro diagnostic
devices)認證(例如歐盟的CE-IVD)，和一般學校及研究機構實驗室使用的RUO
(Research use only)儀器等級不同(例如Bio-Rad的CFX96 Dx有IVD認證，CFX96 Touch
就沒有)，前者要求的精確度及容許的誤差範圍較後者嚴格許多，以公差來比喻的話
，每個一點點點的誤差到最後累積起來會導致嚴重的偏差(deviation)，所以並不是隨
便一台能跑PCR的機器搬來就可以用。另一方面，即便弄到具有IVD認證的儀器，每台儀
器在上工運作前也都必須要經過驗證(Qualification)與確效(Validation)，以一台PCR
機器來說驗證至少要做IQ、OQ、PQ，確效則至少要做分析方法及電腦化軟體的確效，並
不是機器從109、112、113、114、1XX……搬來昆陽或XX醫院插上插頭就馬上可以用，
因為你不知道搬運的過程對機器是否有影響(例如某個well的sensor撞壞啦之類的，就
算是平常大家離心時都沒在balance的小烏龜轉軸也是可能撞歪好嗎)，更何況學校或研
究機構不會沒事買IVD level的機器，畢竟使用目的不一樣。
腦袋是用來在遇到問題時思考如何解決問題的
不是用來無腦盲從土法煉鋼瞎做的
Reference
1. https://reurl.cc/GmEW7G
2. https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63
3. https://www.cdc.gov.tw/File/Get/kOlpcBlLkvOvWHLluofgaA
4. https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw
5. https://doi.org/10.1186/s12936-016-1183-z
6. https://science.sciencemag.org/content/298/5594/793
7. https://doi.org/10.2144/000113589
8. https://reurl.cc/zeNxak
9. https://www.youtube.com/watch?v=DBjZ0LIEMNo
(00：00~11：50)
10. https://reurl.cc/MANqpv
11. https://reurl.cc/O0vQGA
免責暨利益衝突聲明
以上資料都盡可能附上reference了，有錯煩請不吝指正，包括錯別字，我雖是個學貸還
沒還完的社畜，但此文僅分享提供些許拙見，絕非文中相關廠商的業配文。
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膽欲大而心欲小 智欲圓而行欲方
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這也是一個方法
但你也要先寫出一個軟體程式來命令電腦執行啊
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嗯嗯
這我知道
但請問和我這篇文的關聯在哪裡？
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我也不知道究竟應該PO哪裡
但八卦版人最多
也看這邊討論得最熱烈就PO這了
如果你覺得有更適當的地方歡迎轉到別版
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假設拿去做pooling PCR的10個抗原快篩陰性樣本中有一個其實是陽性
若是它的CT值本身就很低(病毒量很多)
那麼就算拿去pooling後即便已經被稀釋了十分之一在儀器上還是會顯示Positive
接著再拿去做qPCR就可以得知它真實的病毒量
但是如果這個樣本本身病毒量就不高
也是有可能在稀釋十分之一後又剛好碰上試劑效率不好之類的導致結果呈現Negative
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別說苗栗的數據不可信了
我連每天下午兩點的數據都很懷疑呀
但我怕被罰300萬所以不敢說
※ 編輯: Rosmarin (220.133.28.228 臺灣), 06/19/2021 22:40:42
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