Re: [求救] 去除SDS方法
※ 引述《xenosaga1026 (sam)》之銘言：
: 目前實驗設計是要用IP的方式將目標protein抓下來
: 跑SDS-PAGE後挖點
: 再用Mass的方式來看interaction protein
: 因為使用的是culture cell (293T)
: 怕IP下來的protein量太少Mass會打不到
: 所以目前打算將protein從protein A/G agarose上
: 用 1% SDS elute下來
: 再將4個sample(10cm dish)一起通microcon來濃縮
: 但問題是我怕濃縮後鹽類濃度及SDS濃度會過高
: 不知道microcon能不能去除SDS
: 亦或是有其他方法可以去除SDS呢?
: 目前實驗面臨最大難題就是protein量不夠
: Mass打出來的結果都在不可信區間(用Mastco搜尋 band都在綠色區間)
: 雖然score都有25以上 不知道這些到底能不能用
: 謝謝
把濃縮的步驟在跑SDS-PAGE前完成最簡單
可以把蛋白質沉澱再以少量SDS-PAGE的sample buffer回溶 煮完直接load gel
也可以用MICROCON或其他KIT來完成
和MS相比SDS-PAGE可以容忍較多不純物存在而不會干擾結果
跑完SDS-PAGE染色再取點做in gel digestion
這樣出來的樣品如果in gel操作上沒問題是相當純的 上MS絕對沒問題
一般如果染色的band可以用commassie blue染出那對MS分析應該就很足夠了
如果少到要用到silver stain才能看到的話 那有點危險 成功率較低但仍有機會
要找適合MS的silver stain方法否則會造成干擾
另外mascot的分數是要和他網頁的分數比
他結果的網頁上有一行會講分數要超過多少分 p值才會小於0.05
這分數你每個樣品送去分析都不一樣
可能A樣品要40分就OK B樣品要60分才OK
你說在綠色區間那應該p值都沒有小於0.05
不過分析上有很多其他要注意的
照本文所述很難判斷能不能用
如果是要寫在PAPER上可能還要做MS/MS 不能只看MS分數
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06/04 00:43, , 1F
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