Re: [求救] Ligation 一直無法成功

看板Biotech作者 (de novo)時間14年前 (2011/04/28 11:36), 編輯推噓13(13推 0噓 38→)
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: Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min : ，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取適量塗在含有ampicillin的LB : agar plate上，positive control為未進行digestion的plasmids，negative control : 為digestion後的plasmid，結果positive control長出來的菌落超過50個，但是negative : control和ligation sample都沒有長出任何菌落。 : 以上條件已經重複約10次，做了快三個月了，均無法長出任何colony，請教大家這步驟是否有我未注意到 : 的地方呢？拜託大家了。 我想請問你的 " positive control為未進行digestion的plasmids " 是加了多少DNA 下去 transform 啊 competent cell 是自己做的嗎 可以測一下 transformation efficiency 如果連 uncut 的plasmid 都只長不到100顆的話... ligation product 長不出來也是相當合理的... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.96.93
推
04/28 11:38, , 1F
也不能這樣講，如果一開始用的vector量少還有抗生素濃度高
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04/28 11:38, , 2F
空vector長的少也還算合理。
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04/28 11:39, , 3F
不過我很贊成原PO的說法，也應該檢查細胞的狀況
04/28 11:39, 3F
推
04/28 12:01, , 4F
其實應該換一隻手 做看看XDDD
04/28 12:01, 4F
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04/29 01:59, , 5F
咦～跟我想的一樣～抗生素濃度我想應該也是通用濃度吧
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04/29 02:00, , 6F
所以真的要確認效率～～空vector整個很容易TNTC
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推
04/29 02:13, , 7F
請問TNTC是什麼??
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04/29 02:14, , 8F
我贊成這裡的理論 PC 通常丟2ul進去 有recovery的話 colo
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04/29 02:15, , 9F
-ny數都會爆表才對 我只有做放很久的competent才會PC很少
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推
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too number to count (沒拼錯吧？)
04/29 02:19, 10F
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04/29 02:20, , 11F
嗯 那所以跟我想得是一樣囉 cell真的要check一下 如果放
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04/29 02:21, , 12F
circular form的DNA當PC 應該是整片連在一起的...
04/29 02:21, 12F
推
04/29 11:14, , 13F
不好意思，這邊補充一下，目測的話應該有>100顆，只是
04/29 11:14, 13F
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我講得比較保守，所以打>50顆，因為我也沒實際去數
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另外competent cells是commercial的
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推
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只大於100其實也沒很好說實在的...一片取100ul塗嗎？沒稀釋?
04/29 14:08, 16F
推
04/29 15:26, , 17F
你能算出每microgram長出多少個colony嗎？
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<10^6個的話就不太適合用來做clone
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推
04/29 17:57, , 19F
所以說positive control沒長很多的話代表ligation會長
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不出來嗎？我大概都取20ng左右的plasmid去transform
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competent cells用50 uL，加SOC medium恢復1 hr後
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取300 uL塗盤，不過我在想positive control的數量只是
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參考，ligation如果有成功就一定會長出來吧！還是我的
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認知錯誤了？
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同樣的competent cell lab其他人使用上ok嗎
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04/29 18:36, , 26F
建議測一下competent cell的效率
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或是跟別家要一隻來試試
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04/29 18:38, , 28F
transform完整plasmid應該要爆盤才對XD
04/29 18:38, 28F
推
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如果你的20ng是完整plasmid的話 效率只有5000 cfu/ug
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04/29 19:06, , 30F
可以說是奇差無比。你說是買來的，應該是transformation
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步驟有致命性的錯誤
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04/29 19:08, , 32F
1ng完整plasmid要能長出1000顆菌以上比較正常
04/29 19:08, 32F
推
04/29 19:12, , 33F
建議拿1ng轉進去，recovery後拿1/10菌液出來塗盤
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04/29 19:13, , 34F
如果能長出100顆colony以上，再用來做clone會比較好
04/29 19:13, 34F
推
04/29 19:48, , 35F
所以說因為有成功ligation的plasmid amount很少很少，
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所以如果連positive control都長很少，更何況量少到在
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04/29 19:49, , 37F
膠上都看不出來的正確ligation產物，請問樓上是這個意
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04/29 19:50, , 38F
思嗎？如果有誤解請更正我，謝謝。
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04/29 19:50, , 39F
另外我在想，因為我在transformation的時候，為了省
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04/29 19:51, , 40F
competent cells，都會先等它完全溶解後，再從原本的
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一管100uL分裝50uL到另一管，再進行transformation，
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會不會是因此而降低了efficiency？
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04/29 19:52, , 43F
可是我還是認為如果有正確ligation的話，就算量再少，
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也足以讓E. coli長出來吧！
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推
04/29 21:32, , 45F
沒錯就是這樣。 另外ligation比其它還需要運氣沒有錯
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04/29 21:34, , 46F
vector, insert, ATP, ligase需要同時撞在一起
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04/29 21:35, , 47F
insert濃度還是vector的好幾倍，insert也會自接
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04/29 21:36, , 48F
insert一自接就沒辦法和vector連在一起了
04/29 21:36, 48F
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04/29 21:37, , 49F
即使你一開始vector+insert>200ng 有成功的也不到1ng
04/29 21:37, 49F
推
04/29 21:41, , 50F
嗯嗯～～接成功的機率都少了，更別說還要進去菌體
04/29 21:41, 50F
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04/29 21:43, , 51F
而且我總覺得接成功的比原本就是環形的容易再掉(我的感覺啦)
04/29 21:43, 51F
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文章代碼(AID): #1DkE3Imi (Biotech)
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