Re: [求救] Ligation 一直無法成功

看板Biotech作者 (豆豆奶)時間14年前 (2011/04/28 02:50), 編輯推噓7(7推 0噓 13→)
留言20則, 7人參與, 最新討論串3/4 (看更多)
我ligation做了三個禮拜，參考過很多protocol都失敗，最後是自己亂做做出來的 作法如下： vector: double digest → clean up → CIP → clean up ┐ ├→ ligation insert: double digest → clean up ──────────┘ 特徵：不用做gel extraction 重點：1. restriction enzyme 一定要切乾淨，我是用五倍建議量反應兩倍時間 也就是10倍劑量。不用擔心會亂切，我做到現在還沒發生過這種事 (建議量：反應體積50ul、37度C下1小時，每unit可切1ug的DNA) 2. CIP也要做乾淨，我是用一倍建議量反應兩倍時間 3. vector在double digest和CIP之間的clean也許可以省略 當時會clean是怕restriction enzyme黏在那邊CIP無法作用 但後來聽實驗室其它人都是切完直接加CIP... 4. insert在PCR時template放越少越好，最好<100pg，以免干擾之後的transform 如果不放心的話，可以在PCR結束後加DpnI把template切掉 因為每次我gel extraction完，elute出來的DNA quality都很差，吸光區線一堆鋸齒很醜 我想可能是我做gel extraction的時候，哪個步驟出了問題 後來自己想到也許可以這樣做，莫名其妙就做出來了 ligation product可以拿一些(5~10 ul左右)出來跑膠看有沒有連接成功 如果看得到vector+insert的linear form的band，表示至少有一端連接成功 另一端也成功的機會很大 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 124.218.20.234
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04/28 03:57, , 1F
反應時間長會不會亂切看enzyme吧 不是看運氣的
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然後... ligation不就把linear接起來嗎??
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04/28 03:59, , 3F
跟送進e.coli甚麼關係... 不然buffer裡dNTP幹嘛的?
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推
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記錯 ATP
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推
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請問你的clean up步驟是指做甚麼樣的處理？
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另外，我記得有作CIP的話，一樣會形成環型，只是因為只
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將insert的5' phosphate group接到vector的3' -OH，但
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是vector上沒有5'phosphate group，所以會留有一個nick
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送進E. coli後才會把這個nick補起來。
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嗯 那是我觀念錯誤，我修一下文
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反正這樣做得出來就對了
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clean up是跑這個kit http://tinyurl.com/3n39o57
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一般的gel extraction/PCR clean up kit應該都可以
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一樓，我就是用號稱很容易亂切的EcoRI和BamHI
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※ 編輯: dodomilk 來自: 140.109.40.39 (04/28 10:27)
推
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其實RE跟CIP可以加在一起反應 不過我都是後加CIP不換buffer
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推
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同樓上，RE跟CIP一起加，較省時間
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推
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問一下~100ng的template會長幾顆?
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05/11 11:30, , 18F
至少要10萬顆
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推
03/25 23:56, , 19F
很好奇你老闆看到如此揮霍的restriction enzyme劑量會
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推
03/25 23:56, , 20F
有何反應? 很貴欸
03/25 23:56, 20F
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文章代碼(AID): #1Dk6LayG (Biotech)
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