Re: [求救] Ligation一直失敗~

看板Biotech作者wenwentien (期待雨後的彩虹)時間13年前 (2011/04/09 21:13)推噓7(7推 0噓 9→)

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※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之銘言： : ※ 引述《wenwentien (期待雨後的彩虹)》之銘言： : : 大家好,目前在進行ligation碰到了問題, : : 請大家幫幫忙 : : 我目前要接的insert約1.6k,而vector是8.4k左右 : : insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone, : : TA clone sequence結果正確, insert與多加的限制?切位也都有, : : 之後將insert與vector加入BamH1與Xhol切, 37度, 2.5~3小時~ : : 跑膠結果大小都正確~ : : 經過gel elute之後insert濃度約94ng/micro liter : : 而vector濃度約18ng/micro liter : : V:I condition= 1:5, 因此ligation體積是V:I=1 microliter:5 microliter, : : total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的, : Hi, 這邊就有問題了喔~~ : 所謂vector:insert = 1:5, 指的是molar ratio=1:5, : 不是volume=1:5, 依照您的做法算出來的molar ratio已經高達1:262, : 而且通常vector的濃度至少必須要50ng(100ng would even better), : 18ng有一點太低了, 就算是high copy number + commercial ligation, : 要挑到positive construct應該蠻難的吧~ 不好意思啊,我這邊沒交代清楚, 我ligation時, vector是94ng(94ng*1 microliter), insert是90ng(18ng*5miccroliter).所以對應的體積是V:I=1:5, 又由於我vector長度是insert的5倍,所以molar ratio與體積比相同 : : Ligation用兩種方式進行: : : 在16度裡overnight(a)與4度overnight(b) : : transform也用兩種方式: : : 放冰上15min直接塗盤(c) : : 塗盤之前加入SOC medium, 37度, 1hr後塗盤(d) : : 因此有a-c,a-d,b-c, b-d四個plate, 但今天結果是一個colony都沒長~ : : 想請教各專家, 我會是在哪個步驟出問題呢? : : 謝謝各位專家~ : 關於transform, 請問... 您有做heat shock嗎?? : 不好意思, 因為您說冰上15min直接塗盤, : 我會直接聯想到where is the heat step?? : 在此假設您有做heat shock, : 在請問您為何要用SOC medium啊??? : 您transform的是不是比較特殊的E. coli strain呢? 我的兩種competent cell都是 DH5-alpha, 很常見的E.coli (c)的直接塗盤是真的沒有heat shock (按照protocol的步驟,就只放在冰上,雖然我一開始也很懷疑,但還是決定先follow), 所以alicialai專家認為仍須heat shock比較適合? (d)的transformation就有heat shock,會用SOC medium是廠商附的,由於之前TA clone 是用這款competent cell,有成功,因此就不疑有他, 所以SOC medium是for特殊的菌種嗎?我改成LB會比較好? 謝謝alicialai專家的指導~ 我的做法是transform後加LB進37度shake 1hr再塗盤~ : 目前為止只要不是太龜毛的strain and plasmid, : (是的敝人目前也正shffer在龜毛的S17 and pDM4.. Orz) : ligation and transformation沒出過甚麼大問題說~ : 希望有幫助到您喔^________________^ : 有問題在互相討論~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.39.99.16

推

mingchao

04/09 22:22, , 1^F

04/09 22:22, 1^F

推

aggaci

04/09 22:48, , 2^F

04/09 22:48, 2^F

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Realthugz

04/09 22:49, , 3^F

04/09 22:49, 3^F