Re: [求救] Ligation一直失敗~
※ 引述《wenwentien (期待雨後的彩虹)》之銘言：
: 大家好,目前在進行ligation碰到了問題,
: 請大家幫幫忙
: 我目前要接的insert約1.6k,而vector是8.4k左右
: insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone,
: TA clone sequence結果正確, insert與多加的限制?切位也都有,
: 之後將insert與vector加入BamH1與Xhol切, 37度, 2.5~3小時~
: 跑膠結果大小都正確~
: 經過gel elute之後insert濃度約94ng/micro liter
: 而vector濃度約18ng/micro liter
: V:I condition= 1:5, 因此ligation體積是V:I=1 microliter:5 microliter,
: total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的,
Hi, 這邊就有問題了喔~~
所謂vector:insert = 1:5, 指的是molar ratio=1:5,
不是volume=1:5, 依照您的做法算出來的molar ratio已經高達1:262,
而且通常vector的濃度至少必須要50ng(100ng would even better),
18ng有一點太低了, 就算是high copy number + commercial ligation,
要挑到positive construct應該蠻難的吧~
: Ligation用兩種方式進行:
: 在16度裡overnight(a)與4度overnight(b)
: transform也用兩種方式:
: 放冰上15min直接塗盤(c)
: 塗盤之前加入SOC medium, 37度, 1hr後塗盤(d)
: 因此有a-c,a-d,b-c, b-d四個plate, 但今天結果是一個colony都沒長~
: 想請教各專家, 我會是在哪個步驟出問題呢?
: 謝謝各位專家~
關於transform, 請問... 您有做heat shock嗎??
不好意思, 因為您說冰上15min直接塗盤,
我會直接聯想到where is the heat step??
在此假設您有做heat shock,
在請問您為何要用SOC medium啊???
您transform的是不是比較特殊的E. coli strain呢?
我的做法是transform後加LB進37度shake 1hr再塗盤~
目前為止只要不是太龜毛的strain and plasmid,
(是的敝人目前也正shffer在龜毛的S17 and pDM4.. Orz)
ligation and transformation沒出過甚麼大問題說~
希望有幫助到您喔^________________^
有問題在互相討論~
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