[求救] 菌長出來裡面什麼都沒有

看板Biotech作者 (FENOR)時間15年前 (2011/01/20 16:51), 編輯推噓8(8020)
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這一個月來每次做clone都遇到這樣的事情, 在ligation並且transform進去之後到菌落長出來這一個步驟都沒有問題, 可是每次用長出來的菌落來抽mini-prep,抽出來的產物digest後拿去跑膠, 每次跑都是空的,連vector都沒有, 這是怎麼一回事啊@@ 我已經快被這樣的情況搞死了.....總覺得我不太適合這一行。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.135.214

01/20 17:02, , 1F
你菌是不是養過頭壓
01/20 17:02, 1F

01/20 17:06, , 2F
應該不是,我只養了16-18小時(transform完)
01/20 17:06, 2F

01/20 17:07, , 3F
挑菌養到MEDIUM裡面也只養了六七個小時就抽了
01/20 17:07, 3F

01/20 17:50, , 4F
挑菌養要不要也養個16小時左右???
01/20 17:50, 4F
其實比較擔心的是抽出來是全空的,這次抽出來就是全空的@@ 我現在正在讓菌長久一點,大概晚上九點還要再抽一次, 應該會跑一個不digest直接比較絕對大小的看看, 如果這樣還是空的那我大概得去檢查competent cells了。 (可是這一批其實去年十一月用都還好好的...) ※ 編輯: FENOR 來自: 140.112.135.214 (01/20 17:53)

01/20 18:01, , 5F
你不digest要怎麼比大小???還有competent cell去年11月好好
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01/20 18:02, , 6F
的,不代表現在就是好好的,擔心的話就做個positive control
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01/20 18:13, , 7F
跟空的vector比@@ 其實我只是想先看看裡面有沒有東西而已
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01/20 18:14, , 8F
晚點我來transform一個只有vector的好了
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01/20 18:15, , 9F
還有就是你的抗生素加的夠不夠壓,如果不夠菌也是會丟掉
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01/20 18:16, , 10F
plasmid唷
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01/20 18:17, , 11F
連vector的band都沒有嗎? 還是只有insert的沒有?
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01/20 18:18, , 12F
去測一下DNA濃度吧,說不定抽太少了看不到
01/20 18:18, 12F

01/20 18:23, , 13F
理論上沒vector的菌不太可能會長,要不要檢查一下抗生素
01/20 18:23, 13F

01/20 18:25, , 14F
是連vector的band都沒有......抗生素是新的
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01/20 18:26, , 15F
抗生素的濃度應該是剛好。
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01/20 18:27, , 16F
況且就算是雜菌,應該也要有genomic或者是一些小片段
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01/20 19:26, , 17F
手抽過嗎?有沒可能是miniprep的問題?
01/20 19:26, 17F

01/21 00:42, , 18F
我有個問題...看時間來養菌這不是個很準的方法
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01/21 00:43, , 19F
你手邊沒有儀器可以測一下菌的濃度嗎
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01/21 00:43, , 20F
另外我覺得抽不到只有一個可能..菌早就死了 在你抽之前
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01/21 00:44, , 21F
就流光了
01/21 00:44, 21F

01/21 00:56, , 22F
樓上提到的這點我沒考慮過@@ 剛好有儀器,晚點來試試看
01/21 00:56, 22F

01/21 01:03, , 23F
你用kit抽嗎 如果DNA流掉了 在你加各種buffer的時候
01/21 01:03, 23F

01/21 01:03, , 24F
應該會有幾步跟你之前抽成功的時候 加進去的反應不太一樣
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01/21 01:03, , 25F
觀查一下
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01/21 01:04, , 26F
也可能像iceking說的量太少 總之只要量不夠一定會有幾步
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01/21 01:05, , 27F
一看就知道不太一樣~~~~ 前提是你常常抽 看習慣了..
01/21 01:05, 27F
其實我現在已經看得出來了@@ PD1 PD2 PD3加下去的產生的變化會不一樣, 最晚等到離心離下來就可以知道裡面到底有沒有東西。 不過說真的,失敗的經驗累積成這樣還真的讓人哭笑不得....... ※ 編輯: FENOR 來自: 140.112.135.214 (01/21 11:59)

01/22 14:11, , 28F
搖太久amp都被消耗光當然沒plasmid
01/22 14:11, 28F
文章代碼(AID): #1DD_UGg2 (Biotech)
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