Re: [求救] cloning實驗做到digest gelpurificatio …
※ 引述《honeytea96 ()》之銘言：
: 小妹我目前在做關於cloning及biosensor相關的實驗
: 一開始做PCR 用proof reading Taq做了好幾次都鬼打牆 量非常少
: 後來老師可以用普通的Taq做 目前做出最好的情形大概是以下的照片
: http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868394307/in/photostream/
建議用2% gel跑，至少你的gene可以跟primer分開一點
: 三個sample都是P recA 基因
: 後來純化將三管混合作 PCR product的purification 圖大概是這樣(從右邊數來第二個)
: (PCR純化我是用kit作 最後Elution solution的量是加12ul)
^^^^^^^^^
你指的是clean up嗎？
這個步驟我建議你elution體積可以多一點
誠如版友所說的30-40ul，然後直接把它全部都拿去切
: http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868396741/in/photostream/
: (不知道為什麼變比較淡~"~)
: 後來繼續作到BamHI和XbaI的double digest 以下是digest program
: [insert] [vector]
: volume(uL)
: buffer3 3 3
: BSA 3 3
^^^
你有稀釋？我通常就拿原液意思意思加1ul
感覺他的功用就是幫忙穩定enzyme之類的(?)，濃度不用很在意
: insert 8 5
: BamHI 0.3 0.3
: XbaI 0.3 0.3
: dH2O 15.4 18.4
你可以做50ul，insert DNA就拿剛剛clean up後的DNA全部都下
enzyme不用這麼省，各1ul（因為我要確保它真的切乾淨，如果DNA量很多我還會再加）
其實這一步阿我會做到不補水，也就是說bf 5, BSA 1, enzyme各1,
所以clean up我會elute 45-50 ul....（elute完體積會少一點）
然後37度作用個4小時
vector的製備也是，你要確保它真的都能切得很乾淨
當然每經過一步純化，一定會lost掉很多DNA
所以一開始你就要有很多vector（反正就菌養多一點萃）
insert是PCR來的，應該會有很多吧??
: 這是digest overnight 後的圖(抱歉已經切過膠)
: http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869015092/in/photostream/
我覺得你這樣切有點危險耶，要不要跑2%，跑開一點
還有要記得限制酵素作用的那管全部都要下去gel extraction
vector一樣切膠純化，當然啦不要浪費全都要拿去gel extraction
vector部份用1% gel，一樣要跑開一點
另外，還有一個觀念要說
雖然gel上看不到，但不代表DNA不存在
如果確保每個步驟都沒問題，雖然電泳看不見，也是可以做ligation的
最後再小提醒一下，PCR產物直接切，記得primer切位要留幾個mer喔～～～
以上，祝福你實驗順利！
: 中間第二到第四個由左至右算起分別是
: vector.insert.100bp marker. 1kb marker
: 經過切膠之後 用kit作purification 結果照出來就完全沒東西了Q_Q
: http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869017390/in/photostream/
: 已經經過了大概3次重複整個實驗過程
: 都是到最後沒辦法作到ligation的部份
: 雖然我覺得是後來digestion之後量變少
: 但真的事要量夠多到後來純化過colum跑膠才看的到嗎
: 希望各位大大能給一些意見喔 謝謝!!!
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