[求救] cloning實驗做到digest gelpurificatio …

看板Biotech作者時間14年前 (2010/08/08 00:58), 編輯推噓4(4推 0噓 41→)
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小妹我目前在做關於cloning及biosensor相關的實驗 一開始做PCR 用proof reading Taq做了好幾次都鬼打牆 量非常少 後來老師可以用普通的Taq做 目前做出最好的情形大概是以下的照片 http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868394307/in/photostream/ 三個sample都是P recA 基因 後來純化將三管混合作 PCR product的purification 圖大概是這樣(從右邊數來第二個) (PCR純化我是用kit作 最後Elution solution的量是加12ul) http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4868396741/in/photostream/ (不知道為什麼變比較淡~"~) 後來繼續作到BamHI和XbaI的double digest 以下是digest program [insert] [vector] volume(uL) buffer3 3 3 BSA 3 3 insert 8 5 BamHI 0.3 0.3 XbaI 0.3 0.3 dH2O 15.4 18.4 這是digest overnight 後的圖(抱歉已經切過膠) http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869015092/in/photostream/ 中間第二到第四個由左至右算起分別是 vector.insert.100bp marker. 1kb marker 經過切膠之後 用kit作purification 結果照出來就完全沒東西了Q_Q http://www.flickr.com/photos/52798131@N04/4869017390/in/photostream/ 已經經過了大概3次重複整個實驗過程 都是到最後沒辦法作到ligation的部份 雖然我覺得是後來digestion之後量變少 但真的事要量夠多到後來純化過colum跑膠才看的到嗎 希望各位大大能給一些意見喔 謝謝!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.230.223.238 ※ 編輯: honeytea96 來自: 61.230.223.238 (08/08 00:59) ※ 編輯: honeytea96 來自: 61.230.223.238 (08/08 01:01)
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your album is private, not publicly accessible
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>"< sorry~~~已更正
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試著利用TA-cloning 放大 insert ，vector 也多一點去切！！
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之前我也是在切完膠後純化 發現效率很差 出來最多剩60%
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為什麼gel extraction之後還要再跑一次gel呢?不就切你要
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的band,做完gel extraction就可以拿去digest了嗎
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"Elution solution的量是加12ul"...是哪一牌的kit這麼厲害?
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回M大 我的程序大概是PCR=>跑膠看band=>purification
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=>跑膠=>digestion=>全load切膠=>純化(目前是這樣)
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嗯,我的意思是你第一次gel purification之後,拿到DAN就可
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以拿去切了,你只cut right band的話大部分DNA都會是好的
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不需要在做一次purification,每做一次conc就少一半
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不太懂為什麼每次你的purification後還要跑膠,那跑膠後
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DNA又要怎麼extract?
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恩,因為我PCR過後是直接過colume純化 沒有經過切膠再
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gel purification的步驟 我也在想是不是就直接把所有的
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PCR product全部load膠切膠再純化 因為PCR本身primer
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dimer也很多 但是之後digestion還是要經過一次切膠純化
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還是有其他方法可以使純化次數減少?
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或是直接拿digestion product去作ligation 不知道這樣
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可不可行??@@
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推
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PCR效率看起來頗差..直接P genomic DNA嗎?template量?
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看能不能想辦法P多一點...但還是建議gryou大說的,
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先用TA cloning,放大片段再下去切,量多又純又可定序
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你的方法一開始PCR產物量就少了 而過一次純化kit會少50%
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kit只用12ul elute雖然濃度會高一點 但elute的總量會更少
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推
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大概懂你怎麼做的了,第二張圖顯示你PCR purification kit
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也沒辦法把primers濾掉,不如就全部直接load做gel purify
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最後就會少到無法做後續
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可以PCR多個五六管一起load膠做Gel purification
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elute用35~40左右 然後直接digestion 但ligation可能不
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=>digestion=>gel purify=>ligation,我沒做過切完後不純
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適合RE的酵素 還是純化比較好 (但量又會更少 囧)
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化的,可能可行但至少要heat inactivate吧
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回mattmatt大 我是P Ecoli K12的genomic DNA沒錯
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量是加4ul(濃度50ng/ul) cycle數是40 所以還是量太少
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嗎@@ 總之我會照mattmatt大&match308大的建議去做做看
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的!!! 謝謝大家的回應~!!
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不能改善PCR的條件增加產量看看嗎@@?
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大概已經作了十次以上的PCR 這個大概是最好的條件了@@
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推
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PCR的效率確實不好,但gel purification的效果也不好....
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可以試著提高gel濃度,跑開一點再切膠嗎?我覺得問題不在於
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PCR產量(如前幾位所言,用個4,5管也就夠了),問題在於純化不
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推
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純化效果差,可以loading 60ul PCR product,純化時加25ul
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ddH2O之類的,或是換個kit純化(要個試用品,看哪個合適也行)
08/09 22:37, 45F
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