Re: [求救] 請問有人用過中研院lentivirus express …

看板Biotech作者icome (木村阿宅)時間14年前 (2010/05/13 12:08)推噓4(4推 0噓 2→)

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這支lentiviral vector好像不好做最近把midi抽出來的plasmid拿去跑膠才發現plasmid跟本就有問題其中四個跑出來只有200bp有band 另外一個放大的空vector是比原本的稍小但是也多了200bp的鬼東西但當初mini prepare出來的plasmid是正確的!!同樣的菌拿去放大就出問題!! 查了一些資料說LTR很容易讓plasmid發生recombination! 我用的是DH5alpha 其他實驗室的人說他們都是用stbl3做的... 不知道有沒有人有類似經驗? : : 我目前用中研院給的pLKO AS2.neo做virus : : 外源基因有成功接入 : : 用LNCaP當作被感染的細胞 : : 經感染後用G418處理約三天沒有看到細胞有死亡的現象 : : 且細胞型態有所改變和使用shRNA病毒感染的狀況一樣 : : (變得較細長因為對照組也有同樣狀態故應是一般狀況) : : 但是跑Western卻看不到所要表現的蛋白!! : : 一開始認為是cloning出問題可能是frame shift : : 但是四組實驗組(獨立的construct)都同樣狀況我當初用Pfu 效果應該不會這麼糟! : : 總之我會拿去定序如果真的是四組都frame shift那也真是太賽了.. = = : : 我想請問的是如果不是construct出錯可能是哪裡有問題呢? : : 目前是猜測titer太低...但如果是MOI太低在G418 selection時應該很多細胞死掉才對? : : 怎麼樣都想不透啊.......有人用這套系統成功表現過嗎? 感謝回答! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.97

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aceliang

05/13 12:21, , 1^F

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Fourfish

05/13 12:46, , 2^F

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icome

05/14 18:21, , 3^F

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