Re: [求救] 請問有人用過中研院lentivirus express …

看板Biotech作者icome (木村阿宅)時間14年前 (2010/04/28 12:46)推噓1(1推 0噓 4→)

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日前中研院打電話來說當初給我的vector可能是抗puro不是抗neo... 我從先前定序的資料去比對確定是as2.puro這支以為找到原因很高興地用pruo去篩 (用T47D細胞) 四天後control組大概死了一半被感染的細胞活得很正常想說終於成功了吧! 很興奮地去跑western... 結果!!還是沒東西!!連一點鬼影都沒有!! 拿去定sequence 從頭到尾完全正確!! vector上的PCMV序列我也有對過完全無誤!! 有人可以解釋這個詭異的現象嗎......... ※ 引述《icome (木村阿宅)》之銘言： : 我目前用中研院給的pLKO AS2.neo做virus : 外源基因有成功接入 : 用LNCaP當作被感染的細胞 : 經感染後用G418處理約三天沒有看到細胞有死亡的現象 : 且細胞型態有所改變和使用shRNA病毒感染的狀況一樣 : (變得較細長因為對照組也有同樣狀態故應是一般狀況) : 但是跑Western卻看不到所要表現的蛋白!! : 一開始認為是cloning出問題可能是frame shift : 但是四組實驗組(獨立的construct)都同樣狀況我當初用Pfu 效果應該不會這麼糟! : 總之我會拿去定序如果真的是四組都frame shift那也真是太賽了.. = = : 我想請問的是如果不是construct出錯可能是哪裡有問題呢? : 目前是猜測titer太低...但如果是MOI太低在G418 selection時應該很多細胞死掉才對? : 怎麼樣都想不透啊.......有人用這套系統成功表現過嗎? 感謝回答! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.97

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ranilla

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