Re: [求救] 如何使重組蛋白變成soluble protein

看板Biotech作者 (187)時間14年前 (2010/04/25 00:41), 編輯推噓8(8推 0噓 12→)
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※ 引述《what15 (小蛙)》之銘言： : 小妹目前在做重組蛋白的表現 : 使用的E.col為BL-21 : vector為pET-20b : 實驗到目前做的還蠻順利的 : 不過表現出來的蛋白會形成inclusion body : 也有用denature buffer 純化出來 : 由於protein denature 後會影響protein activity : 所以老闆希望我能想辦法讓recombinant protein直接變成 soluble : 也就是維持它原有的蛋白質活性 ＝ ＝ 順便問一下你是表現真核還原核的蛋白 因為真核的話，用 E.coli 有時會因為缺少醣化之類的修飾讓它活性.結構等變差 如果是原核的，就比較不用擔心這個問題囉 也要確定一下你的蛋白對E.coli來說是不是算有毒的 : 因此叫我try induction condiction : 實驗室目前沒有人做過這一部份（通常都是直接玩denature/renature) : 所以對於這個挑戰還蠻頭大的 : 小妹自己有查過資料 : 有些paper是說可加入chaperon 、heat shock protein或是換plasmid等等 : 但看起來都挺複雜的＠＠ : 不曉得有沒有人做過類似的實驗或是有看過相關的paper（篇幅太大可寄站內信） : 希望大家能幫小妹指點迷津 : 感謝 常見會try的一些方法有 1.一般 inclusion body 的產生是因為蛋白的生產速度 > folding速度，所以可以透過 降溫、降轉速 induction (16度 20度 25度)、降 IPTG 濃度 (一般到 0.1 mM 都還 可以作用) 去爭取 folding 的時間。 2.也或許菌內的環境的環境不適合蛋白folding，所以可以嘗試換菌株去表現，BL-21(DE3) 是一般常用的，還可以試試 BL-21(DE3)Gold、BL-21(DE3)pLys、BL-21(DE3)Codon plus 、BL-21(DE3)Rosetta 等，甚至也聽過有人用 XLI-Blue 表現。 3.換vector，比如用有 lacI 的 pET-28a，或換成帶有 GST、MBP 等 tag 的 vector。 4.Induction 時加入 3~5% 的酒精誘導 E.coli 產生 chaperon 幫助 folding，不過 這我自己做起來沒很穩定就是了。也看過有 paper 加其他藥品比如 diglycine 等。 5.如果蛋白是因為 E.coli 自己的 chaperon 不會幫忙 folding 才變成inclusion body ，那 coexpress 可以作用的 chaperon 或許有幫助，不過技術跟花費相對也較難。 6.用生資軟體分析後把序列做 mutate 或 truncate。 7.真核的蛋白用真核系統去表現...(攤)。 --
推
03/25 20:32,
Λ＿Λ
03/25 20:32
推
03/25 20:34,
咻 一　<丶‵∀′> 路過，大家繼續
03/25 20:34
推
03/25 20:46,
　＝〔~∪￣￣〕
03/25 20:46
推
03/25 20:54,
＝ ◎──◎
03/25 20:54
推
03/25 20:57,
路路路路路路路路路路路路路 路路路路路路路路X
03/25 20:57
推
03/25 21:47,
路路路路路路路路路路路路路△△△△路路路路路路路
03/25 21:47
-- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.97.110 ※ 編輯: sheepfeather 來自: 140.114.97.110 (04/25 01:01)
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04/25 02:05, , 1F
3~5%酒精 還真沒試過
04/25 02:05, 1F
推
04/25 14:36, , 2F
推薦這篇文章
04/25 14:36, 2F
推
04/25 17:38, , 3F
我表現的是病毒的蛋白@@ 謝謝專業的解析
04/25 17:38, 3F
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04/25 17:40, , 4F
小妹會先嘗試看看 如有問題再向大大請教^^
04/25 17:40, 4F
推
04/26 16:51, , 5F
推本篇 只能說純化是ㄧ條不歸路阿
04/26 16:51, 5F
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04/26 16:51, , 6F
不考慮直接refolding???
04/26 16:51, 6F
推
04/26 18:34, , 7F
refolding回去也不見得是原本的folding...
04/26 18:34, 7F
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04/26 18:34, , 8F
能直接拿native protein是最好的選擇 refolding問題多
04/26 18:34, 8F
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04/26 18:35, , 9F
只是拿native protein是很看運氣就是了
04/26 18:35, 9F
推
04/27 00:08, , 10F
唉～老闆這麼說只好這麼做嚕><
04/27 00:08, 10F
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04/27 09:28, , 11F
其實native form也不見的就是 真正的folding
04/27 09:28, 11F
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04/27 09:29, , 12F
只是大家比較認可 不過能不產生inclusion body最好
04/27 09:29, 12F
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04/27 09:30, , 13F
目前試過chaperon大概是最好 通常都可以產出少量的
04/27 09:30, 13F
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native form 不過要純化出來 要很大量
04/27 09:31, 14F
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04/27 19:00, , 15F
沒辦法阿 大家比較認可native form = 真正的folding
04/27 19:00, 15F
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04/27 19:01, , 16F
所以搞蛋白純化才會這麼累 不然要拿denature的簡單很多
04/27 19:01, 16F
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04/27 19:02, , 17F
基本上只要能induction出來 就可以有暴力解 不管溶不溶
04/27 19:02, 17F
推
04/27 22:40, , 18F
在OD0.2的時候就induction~induction時間短一點~
04/27 22:40, 18F
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04/27 22:45, , 19F
降低蛋白質的產量可以讓inclusion body降低很多
04/27 22:45, 19F
再補充一些 確定可以有soluble protein 後，induction 完先把你的菌放到4度C冰個3~4個小時 再看後續你要離心起來冰存還直接破菌純化 我的case是有冰過4度c的菌比起沒有冰過的，純化後的蛋白產量多了2~3倍 另外換不同medium養看看，比如LB換2YT，有時候也會有意外的結果 給你參考 ※ 編輯: sheepfeather 來自: 140.114.97.110 (04/28 03:39)
推
05/10 16:54, , 20F
s大的講解真詳細 偷學一點回去
05/10 16:54, 20F
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