Re: [討論] 有關Western的小問題
※ 引述《complexomic (複合質體)》之銘言：
: 我目前想要收細胞下來，然後破細胞，收集胞內蛋白
: 之前跑2D是先將dish裡面的medium吸掉，再用PBS wash
: 然後加入ripa 500uL 下去破細胞，然後酒精沉澱
: 再用Rehydration buffer回溶，接著就上IEF，再上電泳
: 目前我要做western，實驗室其他有做western的人說
: 先不要把dish裡面的medium吸掉，而是先用PBS wssh
: 然後ripa量不要下這麼大，否則會影響接下來的western
: 我想請問，真的會影響嗎??? 我之前下這樣的量
: 2D跑起來也還OK，只是不知道western這樣做真的會影響嗎
你不先把medium 吸掉
要如何PBS洗??
我一直以為 PBS 是用來洗掉多餘的medium以及你不想要的死細胞
因為medium內有大量的serum 蛋白 你不想看
RIPA的量不要加太大沒錯
因為你這樣可以有比較高的蛋白質濃度
我通常是加100~200ul 之間
取決於cell pellet大小 給你當參考
另外我補上我們實驗室的一些步驟
1. 抽medium, 用 PBS wash the cell, 移除死細胞
2. trypisinize 細胞. 離心
3. 抽上清液, 用冷的Ca/Mg free PBS, 加到細胞pellet的試管裡
4. 在離心
5. 抽去PBS, 加RIPA以及protease inhibitor
之所以用Ca/Mg free PBS是為了避免Ca dependent protease
所可能造成的degredation.
你可以參考看看
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※ 編輯: reinherd 來自: 68.34.59.154 (04/17 07:15)
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04/17 12:01, , 1F
04/17 12:01, 1F
討論串 (同標題文章)
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