Re: [求救] Purification fungi genomic DNA
雖然我之前抽的都是動物的gDNA...
但我怎麼覺得你的步驟怪怪的??
你的過程怎麼會做兩次沈降？（步驟6、12）
照我所知的原理跟抽動物的經驗
應該把步驟10. protease K跟3. extration buffer並在一起處理 煮65度 for 3hr
（目的是破細胞跟切掉proteins）
之後做一到兩次phenol/choroform extraction
（萃取並分離DNA跟其他物質）
再用100% EtOH + sodium acetate沈降 -20度 overnight或RT 30 min （溫度越低越久）
離心、75% EtOH清洗一次、烘乾就可用ddH2O或TE buffer回溶了
之前抽過一次植物的 似乎也沒分兩次沈降
雖然我沒做過抽蕈類...= =a
如果要參考其他protocol來做 我覺得參考plant的可能比較合適
不然看有沒有其他抽過蕈類的人分享作法摟~!!
以上一些建議
※ 引述《ko363630 (打雜路人甲)》之銘言：
: 老闆最近要我抽牛樟芝的gDNA
: 我從自家的分生聖經以及學姐之前的做法下去做
: 雖然有很成功的抽出來
: 但是濃度卻是相當低，老闆說，可能是抽的時候DNA被切碎太多
: 但是我自己覺得不太可能，可能是牛樟芝用的量太少(取1g抽)
: 這是我們的實驗步驟
: 1.濾紙抽氣過濾(無菌水清洗)
: 2.液態氮研磨
: 3.每克菌絲加入4ml extration buffer
: 4.add 4ml phenol/chloroform
: 5.centrifuge(4oC、10000rpm、10min)
: 6.add 1/10 3M Sodium acetate(pH5.2) and 100%EtoH to supernatant at -20oC for
: 2hr
: 7.centrifuge(10000rpm、10min) desupernatants in RT
: 8.add 20mM Tris-HCL(pH:8.0)
: 9.add 1ug RNase in 37oC 30min 150rpm
: 10.add protease K (final concentration 150mg/ml) at 37oC for 60min
: 11.add phenol volume mix, centrifuge(4oC 12000rpm 10min)
: 12.add 1/10 3M Sodium acetate 3x voulme 100% EtoH (Final concentration 70%)
: at -20oC 30min
: 13.centrifuge(4oC 14000rpm 25min)
: 14.add 10mM Tris-HCL(pH:8.0)
: 這是我的實驗流程(第一次嘗試英文請不要care>"< 我才大二，英文還不好)
: 老闆說，這次抽出來的片段碎掉很多。之前曾想過改用lysis buffer 來破菌。
: 自己上網找qaigen、promega 的protocol但是找到大部分都是關於blood、trusses、
: plant、yeast(同樣都是fungi，但是不知道能不能用)
: 想請各位板上的大大不知道能不能提供一些經驗
: (要買kit的先不要好了= = 老闆聽到要花錢不知道會不會殺了我>"<)
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討論串 (同標題文章)
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完整討論串 (本文為第 2 之 3 篇)：