[求救] 請問關於抽取plasmid的問題

看板Biotech作者 ( )時間16年前 (2010/01/12 19:48), 編輯推噓12(12推 0噓 20→)
留言32則, 14人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
我目前是分生新手 有幾個疑問想要問各位先進 我目前在抽取plasmid的實驗 使用的方法是kit的步驟 但是有時候不知道哪邊出錯 取得plasmid 有時候會失敗 有時候會成功 不知道是哪邊出了問題 還有抽取plasmid kit的spin column 可以重複使用嗎? 因為幾次時驗完發現使用量非常大(過濾膜→spin column、solutionI、II、III) 抽取plasmid步驟: 1.離心菌體沉澱物 2.加入200uL solution I，用pipet使其懸浮 3.加入200uL solution II，上下搖晃數次，等溶液變透徹，但沒超過五分鐘 4.加入200uL solution III，上下搖晃後離心 5.吸取上層澄清液，加入spin column離心 6.加入600uL wash solution，離心 重複兩次 7.讓酒精乾，加入40uL elution solution 靜置 7.跑電泳膠片 DNA:dye=4:1 成功率70% 有考慮想要使用傳統的實驗步驟 及從膠體回收DNA目前很像都沒有成功… 因為再次跑膠片卻都沒有band出現 這邊我想要抽取的DNA大小約0.6kbp(從plasmid上面切下來的片段) 回收膠片dna也是用kit的步驟 回收膠體步驟: 1.割下欲回收膠片 2.加入略大於膠體體積的binding solution，加熱 使膠體溶解 3.加入spin column 離心過濾，再加入700uL binding solution 離心 4.wash solution 600 uL，離心 重複兩次 5.酒精乾，加入elution solution 50 uL 6.跑膠片 目前做的實驗沒有我切下來的DNA band出現 不知道在做抽取plasmid與膠片回收的實驗 有什麼需要注意 才可以使成功率提升 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.113.77.200
推
01/12 20:03, , 1F
spin column應該是沒再重複使用~不懂你的()內的意思
01/12 20:03, 1F
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01/12 20:04, , 2F
在膠上純化 是覺得要算回收率 才知道該下多少ug...
01/12 20:04, 2F
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01/12 20:19, , 3F
相同的DNA重複使用spin column應該是沒什麼問題
01/12 20:19, 3F
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01/12 20:21, , 4F
長時間的話還是換個新的比較好
01/12 20:21, 4F
推
01/12 20:25, , 5F
能夠把實驗流程仔細講一下嗎 這樣比較方便大家判斷
01/12 20:25, 5F
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01/12 20:34, , 6F
那我在重新編輯 把步驟附上 感謝
01/12 20:34, 6F
※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (01/12 20:57)
推
01/12 21:15, , 7F
養菌的時間多久呢? 菌太老也會引響產質
01/12 21:15, 7F
養菌overnight
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01/12 21:17, , 8F
你ELUTE太多拉 通常我會減半 (當初拿多少去切體績)
01/12 21:17, 8F
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01/12 21:17, , 9F
RE用多少量的DNA去反應
01/12 21:17, 9F
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01/12 21:19, , 10F
binding solution的量應該比膠多很多喔 看說明書
01/12 21:19, 10F
推
01/12 21:20, , 11F
沒記錯是約1:3
01/12 21:20, 11F
嗯嗯 這邊我加入bind solution 應該有大於三倍
推
01/12 21:26, , 12F
樓上說得沒錯是膠的3倍體積
01/12 21:26, 12F
推
01/12 21:49, , 13F
成功率70%?? 這根有沒有挑到菌比較相關吧= =
01/12 21:49, 13F
挑菌…可是我是用LB直接去養 然後都是同一個菌株養出來的 有時成功 有時失敗 沒有一個穩定的100%成功 還是我自己的問題? 感謝 提供意見 那怎樣才會有再現性 就以抽取DNA與回收膠片的步驟 ※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (01/12 22:08)
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01/13 00:42, , 14F
回收膠wash完後column membrane正中央滴入elution 或ddH20,
01/13 00:42, 14F
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01/13 00:43, , 15F
室溫靜置2~3分鐘後再離心。若是DNA後續有clone處理，建議用水
01/13 00:43, 15F
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01/13 00:45, , 16F
唔..kit回收膠片最後wash完，DNA是在membrane上，非Wash buf中
01/13 00:45, 16F
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01/13 00:50, , 17F
看來抽plasmid問題可能一樣，kit最後Elution步驟和傳統法差異
01/13 00:50, 17F
推
01/13 08:28, , 18F
elution那步我都用(放烘箱加熱)60度的ddH2O x2次 (建議量減
01/13 08:28, 18F
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01/13 08:29, , 19F
半, 就是說明書要30uL,我會改成15uL兩次
01/13 08:29, 19F
推
01/13 08:32, , 20F
挑菌是怎麼挑?有可能沒挑到嗎? 另外LB養得濁濁的不代表就是
01/13 08:32, 20F
推
01/13 08:36, , 21F
spin管不要重複用了啦!少一個變因,各家競爭之下也不會太貴!!
01/13 08:36, 21F
推
01/13 11:06, , 22F
LB應該有加抗生素吧@@? 通常有挑到不太可能出現抽質體
01/13 11:06, 22F
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01/13 11:07, , 23F
失敗的狀況可能有的菌把質體吐掉了
01/13 11:07, 23F
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01/13 11:07, , 24F
個人猜測
01/13 11:07, 24F
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01/13 11:22, , 25F
建議你抽完之後,先去測260/280及濃度...
01/13 11:22, 25F
推
01/13 13:37, , 26F
找人帶比較快
01/13 13:37, 26F
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01/13 20:38, , 27F
雜菌? = =
01/13 20:38, 27F
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01/13 20:40, , 28F
菌液濁濁的不一定是喔 我有一次發現不是E.coli...
01/13 20:40, 28F
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01/13 20:42, , 29F
有的vector很快被吐掉產量很低 都要重新transform養大量
01/13 20:42, 29F
推
01/14 13:24, , 30F
mini應該很好抽才對 通常沒抽到都是挑到雜菌了
01/14 13:24, 30F
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01/17 23:44, , 31F
elute水加溫到75度,加個30ul,看要不要靜置久一點(1hr)
01/17 23:44, 31F
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01/17 23:46, , 32F
有些column爛一點需要久一點時間,原本的plasmid切多點
01/17 23:46, 32F
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文章代碼(AID): #1BJ66TKJ (Biotech)
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