[求救] Western Blot出來的band不清楚

看板Biotech作者 (贏了世界又如何)時間14年前 (2009/12/23 10:17), 編輯推噓2(2推 0噓 15→)
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http://www.wretch.cc/album/show.php?i=steniralc&b=2&f=1288829228&p=0 箭頭所指的地方是我的target protein blocking是用5% 脫脂奶 1hr 一抗是1:1000 ,cell signaling的產品 overnight 在5% BSA中稀釋 二抗是1:2000 ,Jackson的產品 1hr 在5% 脫脂奶中稀釋 但呈色後會有點點(如圖),target地方也很不清楚,有水痕 本來我一抗是一樣用脫脂奶稀釋,其它都一樣 呈色後跟這張圖的問題一樣--target protein很糊,有水痕,但沒有點點 (所以不是transfer有泡) 於是strip後一抗換成datasheet上的5%BSA去稀釋,還是一樣 這兩張membrane的其它部份做的band都非常正常,用的buffer也都是一起配的 請問這是抗體的問題?? 還是在染的過程中哪個小細節沒注意到的?? 請大家賜教~ 感激不盡!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 192.192.93.160
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12/23 12:01, , 1F
transfer時氣泡要弄乾淨
12/23 12:01, 1F
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12/23 12:06, , 2F
不好意思搞錯
12/23 12:06, 2F
推
12/23 12:57, , 3F
一般一抗跟二抗的skim milk為1%，太高有時候背景很雜
12/23 12:57, 3F
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12/23 13:47, , 4F
嗯..所以有的抗體可以用到5%,如果不行就改用1%試看看囉?
12/23 13:47, 4F
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12/23 16:57, , 5F
會是ab訊號太弱嗎? 如果1抗先室溫1hr再overnight呢?
12/23 16:57, 5F
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12/23 16:58, , 6F
室溫會提高1抗的結合率(但若是磷酸化的ab就不建議這樣做)
12/23 16:58, 6F
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12/23 20:15, , 7F
我覺得有可能是 Ab 太弱，可以試試配濃一點，例如：
12/23 20:15, 7F
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12/23 20:15, , 8F
1:500 之類的～或是把 lysate loading 多一點試試
12/23 20:15, 8F
推
12/23 22:37, , 9F
0.5% bsa 4度C blocking 30min 上抗也是0.5% bsa 4度C O/N
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12/23 22:38, , 10F
二抗 用脫脂奶1-3% 可以加量 室溫 1 hr 看看
12/23 22:38, 10F
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12/23 22:38, , 11F
cell signal的抗體 很吃4度C blocking 上一抗 二抗隨便
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12/23 22:39, , 12F
做了MAPK 等等很多支他們家抗體的心得 試試看
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12/23 22:40, , 13F
這家的strip掉要重上 效果不好 所以只有一發子彈 可能多試
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12/23 22:40, , 14F
條件看看 加油
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12/24 09:32, , 15F
這些白點很明顯的就是 transfer 的氣泡...
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12/24 09:34, , 16F
感謝大家的指點!我今天會試看看!! 給樓上:這張圖是strip
12/24 09:34, 16F
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12/24 09:35, , 17F
後上抗體,第一次用時無白點,故不是transfer時造成的泡
12/24 09:35, 17F
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文章代碼(AID): #1BCNtNg4 (Biotech)
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