Re: [求救] 怎麼改善蛋白誘導的solubility?
可是有一點我得補充
如果只是做D70E或者R242A的單點突變的話
這樣的誘導都是可以成功的
但是兩個同時的話,就不行
當然有可能像是你們所說的folding出了問題
或許會試看看加ㄧ些可以促進chaperone表現的物質進去看看吧
至於IPTG的濃度
我不確定uM的等級是否足夠
因為我用的是strigent的表現系統
BL21 (DE3)/ pLysS
我不曉得會不會是我太晚誘導的結果
不過我不太曉得太晚誘導是否是導致protein無法成soluble form的原因
還得看看才知道
很感謝你的回答
最近可能得密集試不同的條件了
大家有不一樣的想法
歡迎一起討論喔
※ 引述《nzj (edger)》之銘言：
: 我不太清楚你的實驗目的為何,不過從結果來看,可以推論這蛋白質的穩定,
: 離子鍵扮演重要的角色,因此當D變成E的時候,因都帶負電所以沒什麼影響,
: 可是當帶正電Arg變成不帶電的Ala,因此無法形成離子鍵,因此會影響蛋白
: 質的穩定,因而影響摺疊。
: 在實驗的部份,用低溫的策略是可行的,不過轉速可以調慢,慢慢震盪就好了,
: 另外表現時菌液的濃度O.D.600=0.8有點高,也許可以試試0.4-0.6。而IPTG
: 的濃度uM等級就可以了。如果再不行的話可以加3-5% 的ethanol促進
: chaperone的表現,也許可以幫助摺疊。表現的部份就試條件,也許運氣好就
: 讓你試到了。
: 當然也可拿inclusion bodies來做refolding,這個方法也不見得會成功
: 。可以將inclsion bodies溶在urea或者guanidium chloride然後將
: solution慢慢倒入refolding buffer,使urea的濃度降到1.8-2.3 M。
: 另外也可將溶在urea的proteins以梯度透析的方式降低urea的濃度,
: 避免濃度變化過快,而影響proteins folding。另外也有一種方法就
: 是改變pH值將cofactor加入。方法有很多,不過還是要看蛋白質的特性。
: 如果還是不行,就試試不同的表現系統,如真菌的yeast。glycosylation
: 會穩定蛋白質的結構,也許可以幫助蛋白質摺疊。
: 另外很多膜蛋白不溶於極性的溶液中,因此加入detergent,來幫助solubility。
: 這個方法可用來養晶。
: ※ 引述《BLACKOA (OA)》之銘言：
: : 大家好,小弟在蛋白誘導上遇到了一個問題
: : 我想要誘導的蛋白原本是在D70E有做改變
: : 然後我在BL21/pLysS,在pET15b(low copy number)上做誘導
: : 簡單的誘導過程如下:
: : 1. O/N culture in LB with antibiotics and 0.1% glucose
: : 2. 1:100 diluted in 200ml LB (500ml flask) with 0.01% glucose
: : shaking culture at 37度C, 200 rpm until OD600 reaches 0.8
: : 3. add IPTG to final concentration 1mM and shaking culture at 18度C, 200rpm
: : 4. 1 hour later, collect bacteria and disrupt them
: : 5. pellet and the supernatant of the disrupted bacteria were collected
: : 6. western blot
: : 基本上是這樣,然後可以看到只有D70E突變的蛋白可以明顯誘導出來,而且是
: : soluble form居多(因為可以在disrupted bacteira的supernantant看到誘導的蛋白)
: : 可是
: : 假如同時做R242A的突變時(也就是現在的蛋白同時有D70E跟R242A的突變)
: : 在同樣的系統與條件下誘導的時候
: : 卻發現蛋白主要都是在inclusion body裡面,幾乎都是insoluble form
: : 覺得很奇怪
: : 不曉得有沒有人對於這個有任何想法嗎?
: : 我自己正在試降低IPTG的濃度(想要試0.5mM, 0.1mM, 0.05mM),
: : 然後想要把induction的溫度降到16度C
: : 想要試著降低誘導的速度
: : 看能不能改善蛋白的溶解度
: : 不過,
: : 想在這邊跟大家請教看看有沒有別的想法
: : 謝謝
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