Re: [求救] 怎麼改善蛋白誘導的solubility?
我不太清楚你的實驗目的為何,不過從結果來看,可以推論這蛋白質的穩定,
離子鍵扮演重要的角色,因此當D變成E的時候,因都帶負電所以沒什麼影響,
可是當帶正電Arg變成不帶電的Ala,因此無法形成離子鍵,因此會影響蛋白
質的穩定,因而影響摺疊。
在實驗的部份,用低溫的策略是可行的,不過轉速可以調慢,慢慢震盪就好了,
另外表現時菌液的濃度O.D.600=0.8有點高,也許可以試試0.4-0.6。而IPTG
的濃度uM等級就可以了。如果再不行的話可以加3-5% 的ethanol促進
chaperone的表現,也許可以幫助摺疊。表現的部份就試條件,也許運氣好就
讓你試到了。
當然也可拿inclusion bodies來做refolding,這個方法也不見得會成功
。可以將inclsion bodies溶在urea或者guanidium chloride然後將
solution慢慢倒入refolding buffer,使urea的濃度降到1.8-2.3 M。
另外也可將溶在urea的proteins以梯度透析的方式降低urea的濃度,
避免濃度變化過快,而影響proteins folding。另外也有一種方法就
是改變pH值將cofactor加入。方法有很多,不過還是要看蛋白質的特性。
如果還是不行,就試試不同的表現系統,如真菌的yeast。glycosylation
會穩定蛋白質的結構,也許可以幫助蛋白質摺疊。
另外很多膜蛋白不溶於極性的溶液中,因此加入detergent,來幫助solubility。
這個方法可用來養晶。
※ 引述《BLACKOA (OA)》之銘言：
: 大家好,小弟在蛋白誘導上遇到了一個問題
: 我想要誘導的蛋白原本是在D70E有做改變
: 然後我在BL21/pLysS,在pET15b(low copy number)上做誘導
: 簡單的誘導過程如下:
: 1. O/N culture in LB with antibiotics and 0.1% glucose
: 2. 1:100 diluted in 200ml LB (500ml flask) with 0.01% glucose
: shaking culture at 37度C, 200 rpm until OD600 reaches 0.8
: 3. add IPTG to final concentration 1mM and shaking culture at 18度C, 200rpm
: 4. 1 hour later, collect bacteria and disrupt them
: 5. pellet and the supernatant of the disrupted bacteria were collected
: 6. western blot
: 基本上是這樣,然後可以看到只有D70E突變的蛋白可以明顯誘導出來,而且是
: soluble form居多(因為可以在disrupted bacteira的supernantant看到誘導的蛋白)
: 可是
: 假如同時做R242A的突變時(也就是現在的蛋白同時有D70E跟R242A的突變)
: 在同樣的系統與條件下誘導的時候
: 卻發現蛋白主要都是在inclusion body裡面,幾乎都是insoluble form
: 覺得很奇怪
: 不曉得有沒有人對於這個有任何想法嗎?
: 我自己正在試降低IPTG的濃度(想要試0.5mM, 0.1mM, 0.05mM),
: 然後想要把induction的溫度降到16度C
: 想要試著降低誘導的速度
: 看能不能改善蛋白的溶解度
: 不過,
: 想在這邊跟大家請教看看有沒有別的想法
: 謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.230.86
討論串 (同標題文章)