Re: [求救] clone 問題~vector會自黏

看板Biotech作者 (分手後才真正的認識你)時間16年前 (2009/05/25 17:40), 編輯推噓8(8推 0噓 14→)
留言22則, 9人參與, 7年前最新討論串2/2 (看更多)
借標題問一下 最近我也遇到很類似的情況 ligation之後 都是self ligation 一開始是懷疑insert 沒切好 後來是懷疑plasmid沒抽好 所以切的時候有問題 所以後來有做check 我的plasmid大概7.5kb 用兩個RE (SalI&NotI) 各切一刀 之後 和沒有切的plasmid跑電泳比較 結果~~怪事發生了!!! 沒有切的就是supercoli form 大概在marker 7~8之間 但是各切一刀的 分子量竟然變成9~10之間 雖然很想懷疑是沒跑下來 但是因為marker都有跑開 分的很清楚 應該不是膠的問題 所以現在轉向是buffer的問題 但NEB的buffer應該品質很穩定吧?而且我是拿新的來做 遇到這個問題該怎麼解決???????? 還有請問大家 遇到RE doule digestion的時候 要用不同buffer的時候會怎麼做? 我一直以來都是用clean up的方式去換buffer 就是最後用要換的那個buffer elute出來 但最近不知道為什麼 見鬼的一直切不動 後來是用補NaCl和Tris的方法 才切動 這我真的很不了解 到底在eppendof中是發生什麼事了@ @ ※ 引述《afunafun (afunafun)》之銘言： : 建議vector 作RE取的濃度不要太高 還有切完記得跑膠 看有無切開 : 原po說vector會切下的片段很小無法分辨 : 其實很簡單 跑1%的gel 分別load有切跟沒切的 : 有切開的會變成直線 所以大小應該跟原始質體大小一樣 : 至於沒切的質體依然是環狀 跑膠會跑比較快 : 藉由兩者比較很容易分辨 RE有沒有切得很成功 : PS. 兩個RE site切開後 確定不會互黏 就不需要做CIP了 : 我自己都不做 因為省時間 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 202.169.162.125
推
05/25 18:14, , 1F
linear form比較上面不是很合理嗎？
05/25 18:14, 1F
推
05/25 18:39, , 2F
我是覺得你的vector上應該有接上什麼東西..
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05/25 18:39, , 3F
所以size已經不是你預期的7.5Kb了
05/25 18:39, 3F
推
05/25 19:02, , 4F
supercoil form跑得比linear form低不是很正常嗎XD
05/25 19:02, 4F
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05/25 19:03, , 5F
你的問題是在於為何應該掉一段insert出來卻沒掉嗎?
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而且plasmid 7.5k直接跑的話應該會比7k還低歐
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05/25 19:04, , 7F
最有可能就是你拿到的map跟你的plasmid不合
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05/25 19:04, , 8F
所以你的plasmid已經有修改過了 可能接過什麼東西
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05/25 19:27, , 9F
要不要去定序看看
05/25 19:27, 9F
推
05/25 20:01, , 10F
感覺是plasmid發生問題，切一刀怎麼可能比原來的大...
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推
05/25 20:11, , 11F
NEB的double digestion有一張buffer表
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上面寫要作seq的在分開做sequential就好
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推
05/25 20:17, , 13F
05/25 20:17, 13F
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05/25 22:16, , 14F
plasmid是買來的 (novagen) 買來就transform
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本身是空的 應該沒問題 只是因為construct有問題才會check
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就算linear form會比較高 但應該也不會大於本來分子量吧
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前面問的是novagen買來的plasmid的情況 下面double
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digestion用的是另一個實驗室裡已經有接insert的plasmid
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怎麼切都切不出insert 後來補文中提的東西才切動@ @
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推
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現在要切的切位有沒有因為之前的clone動到了,RE不能辨識了?
05/25 22:42, 20F
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11/11 01:29, , 21F
你的問題是在於為何應該 https://noxiv.com
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01/03 16:55, 7年前 , 22F
supercoil f https://daxiv.com
01/03 16:55, 22F
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文章代碼(AID): #1A6cUBkX (Biotech)
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