Re: [求救] clone 問題~vector會自黏

看板Biotech作者 (afunafun)時間15年前 (2009/05/22 00:57), 編輯推噓3(3推 0噓 9→)
留言12則, 5人參與, 5年前最新討論串1/2 (看更多)
建議vector 作RE取的濃度不要太高 還有切完記得跑膠 看有無切開 原po說vector會切下的片段很小無法分辨 其實很簡單 跑1%的gel 分別load有切跟沒切的 有切開的會變成直線 所以大小應該跟原始質體大小一樣 至於沒切的質體依然是環狀 跑膠會跑比較快 藉由兩者比較很容易分辨 RE有沒有切得很成功 PS. 兩個RE site切開後 確定不會互黏 就不需要做CIP了 我自己都不做 因為省時間 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.229.40
推
05/22 01:36, , 1F
你忽略通常兩個RE會在MCS,切開的產物可能數十bp而已,差異看
05/22 01:36, 1F
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05/22 01:38, , 2F
不出來,也因此就算變成直線,你也不知有沒有單切,這會互黏的
05/22 01:38, 2F
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05/22 02:02, , 3F
通常可以切久一點 或是ligation結束後去活性 接著
05/22 02:02, 3F
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05/22 02:04, , 4F
再利用兩切點間的另一個單一切點 切1小時
05/22 02:04, 4F
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05/22 02:05, , 5F
就可將未接入insert的質體切開
05/22 02:05, 5F
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05/22 02:06, , 6F
不過要注意insert不能有這第三個切點的切位
05/22 02:06, 6F
推
05/22 08:22, , 7F
其實切久一點在配上CIP處理 就不太怕單切的問題了
05/22 08:22, 7F
推
05/22 11:58, , 8F
我其實也沒在做CIP的..然後我都會切很久盡量切乾淨，再elute
05/22 11:58, 8F
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05/22 11:59, , 9F
沒切的跟切的跑在同一片膠就可以知道了，我的環狀沒切的會跑
05/22 11:59, 9F
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05/22 12:00, , 10F
比較慢耶... 當然要確定兩個酵素都沒問題拉！
05/22 12:00, 10F
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11/11 01:29, , 11F
你忽略通常兩個RE會在 https://noxiv.com
11/11 01:29, 11F
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01/03 16:55, 5年前 , 12F
你忽略通常兩個RE會在 https://muxiv.com
01/03 16:55, 12F
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文章代碼(AID): #1A5OVdNg (Biotech)
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